MYADM靶向的siRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了MYADM靶向的siRNA及其应用，属于分子生物技术与基因工程技术领域。本发明专利技术提供抑制MYADM基因表达的小干扰RNA及其应用，通过在食管癌细胞中转染该小干扰RNA，能调控和干扰MYADM基因表达，降低细胞克隆形成能力，抑制细胞伤口愈合和侵袭；因此抑制MYADM基因表达的小干扰RNA，通过降低MYADM的表达，能有效抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭。本发明专利技术为食管癌治疗提供了一个新的潜在药物，具备很高的临床实际应用前景和价值。的临床实际应用前景和价值。的临床实际应用前景和价值。

【技术实现步骤摘要】
MYADM靶向的siRNA及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物技术与基因工程
，更具体地说，涉及MYADM靶向的siRNA及其应用。

技术介绍

[0002]食管癌是世界范围内的主要公共卫生问题，也是最具侵袭性的恶性肿瘤之一。尽管近年来已经取得了相当大的诊断和治疗进展，但由于转移和侵袭率高，食管癌患者的预后仍然很差。研究转移和侵袭相关基因对食管癌细胞增殖和转移的作用，对改善食管癌患者的预后都有重要理论意义和应用价值。
[0003]RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，应用RNAi技术特异性地向哺乳动物和人类的细胞中导入小干扰RNA来降低靶基因的表达，进而引起靶蛋白的表达下降，可以达到高效特异性的基因治疗作用。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种MYADM靶向的siRNA。本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述MYADM靶向的siRNA在制备用于治疗食管癌的药物中的应用。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0006]一种MYADM靶向的siRNA分子，是核酸序列如下的双链RNA分子：
[0007]正义序列：5
′‑
CGGCGAGAUCACUGGCUAUdTdT
‑3′
，
[0008]反义序列：5
′‑
AUAGCCAGUGAUCUCGCCGdTdT
‑3′
。
[0009]所述的MYADM靶向的siRNA分子在制备抗食管癌药物中的应用。
[0010]所述的应用中，所述的抗食管癌药物是降低食管癌细胞克隆形成能力的药物。
[0011]所述的应用中，所述的抗食管癌药物是降低食管癌细胞伤口愈合能力的药物。
[0012]所述的应用中，所述的抗食管癌药物是抑制食管癌细胞侵袭相关基因表达的药物。
[0013]所述的应用中，所述细胞侵袭相关基因为cadherin基因、N
‑
cadherin基因、Vimentin基因或snail基因。
[0014]一种抗食管癌药物，含有所述MYADM靶向的siRNA分子。
[0015]相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0016]本专利技术采用免疫组织化学染色技术检测食管癌中MYADM基因的表达情况，发现MYADM蛋白在食管癌组织中的表达显著高于非癌组织。随后本专利技术针对MYADM基因设计了三种小干扰RNA，通过实验发现，其中一种小干扰RNA，转染食管癌细胞ECA109后，能有效调控和干扰MYADM基因表达，从而降低食管癌细胞克隆形成能力，抑制食管癌细胞伤口愈合和侵袭；因此该MYADM基因靶向的小干扰RNA，具有降低MYADM的表达，有效抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的功能。本专利技术为食管癌治疗提供了一个新的基因靶点和药物，具备很高的临
SH30809.01)培养在5％CO2，37℃的培养箱中。
[0039]细胞转染：按说明书分别将siRNA
‑
1、siRNA
‑
2和siRNA
‑
3稀释成20μM溶液待用；将细胞消化后，铺在6孔板中，当细胞密度汇合到30
‑
50％时进行转染；准备四个无菌1.5mL的EP管，分别在四个EP管中加入OPTI
‑
MEM 200μL和对应的siRNA
‑
1、siRNA
‑
2、siRNA
‑
3及阴性对照siRNA溶液5μL快速涡旋10s使其完全混匀；再分别向4个EP管中加入6μL siRNA
‑
Mate转染试剂，室温静置10min，使siRNA和转染试剂形成转染复合物，再加入6孔板对应的孔中，轻晃摇匀；2天后，免疫印迹法验证敲低效率以及进行细胞功能实验。如图1所示。
[0040]蛋白表达量的结果如图2所示，可以看出，与对照组比较，转染小干扰siRNA1(siRNA
‑
1)、小干扰RNA2(siRNA
‑
2)和小干扰RNA3(siRNA
‑
3)的实验组的MYADM蛋白的表达量都降低，从蛋白的相对表达量能清楚得看出，转染小干扰siRNA
‑
1的实验组对MYADM蛋白表达的干扰最大，效果最好。因此可以将干扰MYADM基因表达的siRNA
‑
1应用在干扰MYADM基因表达中，用于后续实施例。
[0041]实施例4：MYADM小干扰片段抑制食管癌转移和侵袭的检测细胞学实验
[0042]1、克隆形成实验证明siRNA
‑
1干扰MYADM导致细胞水平的抗肿瘤效应
[0043]将500个细胞/孔的细胞悬液放入6cm的培养皿中。在37℃孵箱中用3mL培养液培养细胞。培养细胞培养2周后，用PBS温和洗涤，福尔马林固定，0.1％结晶紫染色，测定克隆形成率。如图3所示。a图为克隆形成实验的细胞状态，小干扰MYADM转染的食管癌细胞ECA109增殖能力明显减弱，b图为克隆形成实验的统计学结果，小干扰MYADM转染的食管癌细胞ECA109数量明显下降，该克隆形成实验结果有统计学意义p＜0.05。结果表明，MYADM小干扰RNA干扰的实验组与NC组相比，细胞克隆数显著降低(p＜0.05)，表明MYADM能够促进大鼠ECA109细胞克隆形成，即通过小干扰siRNA
‑
1转染ECA109干扰MYADM基因，能抑制细胞的克隆形成。
[0044]2、Transwell分析实验证明MYADM小干扰片段siRNA
‑
1细胞水平的抗肿瘤效应
[0045]先准备24孔板，将小室移至24孔板内；细胞侵袭实验，基质胶需要提前一天从
‑
20℃放入4℃冰箱，24孔板、枪头、小室都需要提前预冷，所有操作都需在冰上进行；将转染后的细胞从6孔板中消化下来，离心后，弃去上清，留细胞沉淀；加入1mL PBS重悬，离心；再加入1mL PBS重悬，离心，弃上清；加入少些基培重悬，然后取200μL体积内含5
×
105个细胞，置于孔径为8um的Transwell室中，进行或不进行Matrigel处理，并在下部隔室中装入1640含10％FBS的培养基500μL。温育24小时后，移去上腔室细胞悬液，用4％多聚甲醛将下腔室膜上的细胞固定30min，然后用结晶紫染色5min。用显微镜随机选择5个视野来计数迁移或侵袭细胞。结果如图4所示，a图为迁移实验的细胞状态，小干扰MYADM转染的食管癌细胞ECA109迁移能力明显减弱，b图为迁移实验的统计学结果，小干扰MYADM转染的食管癌细胞ECA109数量明显下降，该迁移实验结果有统计学意义p＜0.05，c图为侵袭实验的细胞状态，小干扰MYADM转染的食管癌细胞ECA109侵袭能力明显减弱，d图为侵袭实验的统计学结果，小干扰MYADM转染的食管癌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MYADM靶向的siRNA分子，其特征在于，是核酸序列如下的双链RNA分子：正义序列：5
′‑
CGGCGAGAUCACUGGCUAUdTdT
‑3′
，反义序列：5
′‑
AUAGCCAGUGAUCUCGCCGdTdT
‑3′
。2.权利要求1所述的MYADM靶向的siRNA分子在制备抗食管癌药物中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抗食管癌药物是降低食管癌细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨秋星，张金业，郭丽媛，沈爱国，
申请(专利权)人：南通市肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：