本发明专利技术公开了用于生物酶固定化的磁性聚合物微球及其制备方法。本发明专利技术以亲水性的纳米级磁性颗粒为磁性材料，以乙烯基化合物为功能性单体，以复合表面活性剂为分散剂，用反相悬浮聚合技术制备了粒径分布窄、具有超顺磁性和亲水性的含环氧基团的高分子聚合物珠状载体。用上述磁性载体制备的固定化青霉素酰化酶的表观活性较高，可达３３０ＩＵ／ｇ（湿），而且可以通过外加磁场的作用简便地将固定化酶回收、反复使用，从而提高固定化酶的利用率。本发明专利技术的制备方法工艺过程简单，操作方便，生产成本低，适合于大规模生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，具体地说， 用反相悬浮聚合技术制备了粒径分布窄、具有核壳结构、超顺磁性、亲水性和 含环氧基团的高分子聚合物珠状载体。技术背景生物酶直接作为催化剂存在着许多不足在高温、强酸、强碱和有机溶剂 中不稳定，容易丧失催化活性；生物酶回收困难，经济上不合理，还造成产物分离、提纯困难，严重影响产品性能，生产过程难以实现连续操作，只能一次 性间歇操作。固定化酶克服了生物酶的以上不足，保持了生物酶特有的催化特 性，提高了操作稳定性，生产过程易于实现连续操作，反应完成后易于与产物 分离而且可以多次反复使用，所得的产品纯度高，生产成本低，因此，酶的固 定化一直是生物化学、催化化学和材料化学等领域的关注热点。酶的固定化技术是使生物酶催化剂得到更广泛且有效利用的一个重要手段，包括以下三个方面的技术①原酶的提取和纯化；②固定化载体的制备； ③酶的固定化。目前生物酶的提纯技术和固定化方法的研究己相对成熟，固定 化酶的成功大多依靠固定化载体的性能。设计、合成性能优异且表面性质和结 构可控的固定化载体，以及工艺过程简单、操作方便、生产成本低和适合于大 规模生产的固定化载体制备方法，仍是生物酶固定化技术研究的重要内容。含环氧基团的高分子聚合物微球，其表面的环氧基团能够在室温条件下开 环与酶分子反应形成共价键，从而在十分温和的条件下实现酶的固定化，这种 借助于环氧基团使酶固定于载体表面，不仅操作简便，而且固定化过程对酶活力损失也很小，因而十分适合于工业化固定化酶的生产。磁性聚合物微球是近二十年来发展起来的一种新型功能高分子材料，微球 表面可以引入多种反应性功能基团，也可以通过共价键来结合酶、细胞、抗体 等生物活性物质；在外加磁场的作用下，磁性载体可以迅速从反应体系中收集 分离，撤去外加磁场则可以重新分散，因此，在酶固定化、免疫检测、细胞分 离、耙向药物等领域有着广泛的应用前景。美国专利US4339337公开了一种用悬浮聚合技术制备乙烯基芳香族聚合物 的磁性微球的方法。在强烈搅拌下，将亲油化处理的磁性Fe304或，Fe203颗粒、 亲油性的乙烯基芳香族单体和油溶性引发剂组成的油相均匀分散在含表面活性 剂的水相中，用悬浮聚合技术制备了亲油性的磁性聚合物微球，但该磁性聚合 物微球不适合于水溶性生物酶的固定化，得到的固定化酶性能较差，而且粒径 分布较宽、磁性颗粒含量较低(0.9 2.7%)。中国专利CN1473558A公开了复合功能超微磁性载体粒子及其制备方法。 它是三层核壳结构的络合物，第一层为Fe304或Y-Fe203，第二层为多糖及其衍 生物或聚乙二醇，第三层为生物活性功能制剂，通过利用物理凝聚法与化学键 合法在超微磁性载体粒子表面包覆生物活性功能制剂，主要用于药物局部治疗 与诊断载体系统的制备。中国专利CN1566169A公开了一种超顺磁性聚合物微球的制备方法及其装 置。通过该专利技术的悬浮聚合反应装置的丝网筛板振动，将油溶性聚合物单体、 油溶性引发剂和油基磁性Fe304纳米颗粒组成的油相均匀分散在含稳定剂(聚乙 烯醇或聚乙烯吡咯垸酮)的水相中，用悬浮聚合技术制备了亲油性的超顺磁性 聚合物微球，但该磁性聚合物微球不适合于水溶性生物酶的固定化，得到的固 定化酶性能较差。中国专利CN101085874A公开了一种亲水性聚合物磁性微球及其制备方法 和用途。用甲酰胺分散超顺磁性Fe304磁粉制备磁流体，与亲水性单体混合组成 聚合相，搅拌下分散于含有稳定剂的疏水性有机溶剂形成悬浮相，用反相悬浮 聚合技术制备了亲水性聚合物磁性微球。用上述磁性微球制备的固定化青霉素 酰化酶的最高表观活性可达795IU/g(37'C，载体干重)，相当于205IU/g(28C， 载体湿重)。但该专利技术的制备方法存在着硬脂酸钙稳定剂洗涤困难和聚合物磁性 微球机械强度低等缺点，严重影响了固定化酶的表观活性和使用寿命。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于水溶性生物酶固定化的粒径分布窄、具有 核壳结构、超顺磁性、亲水性和含环氧基团的聚合物微球及其制备方法。本专利技术以亲水性的纳米级磁性颗粒为磁性材料，以乙烯基化合^;为功能性 单体，以复合表面活性剂为分散剂，用反相悬浮聚合技术制备所述的磁性聚合物微球，包括如下步骤① 将复合表面活性剂溶解于分散相中，加热至45 75°C;② 将亲水性的纳米级磁性颗粒、乙烯基化合物溶解于甲酰胺中或甲醇和水的混合物中，然后加入偶氮二异丁腈引发剂；③ 在氮气保护和强烈搅拌下，将步骤②的混合物转移到步骤①的溶液中进行聚 合反应，反应温度为45 75t，反应时间为3 6小时，反应结束后，通过外加 磁场从反应体系中收集磁性聚合物微球。然后将磁性聚合物微球经过乙醇洗涤、 正庚烷浸泡和真空干燥后即可使用。其中，分散相与乙烯基化合物的质量比为15 19: 1，复合表面活性剂的质 量为乙烯基化合物质量的15 20%，亲水性的纳米级磁性颗粒的质量为乙烯基 化合物质量的3 9%，偶氮二异丁腈的质量为乙烯基化合物质量的5 10%，分 散相与甲酰胺或甲醇和水的混合物的体积比为5 10: 1。所述的亲水性的纳米级磁性颗粒为具有超顺磁性的粒径小于100nm的 ，Fe203颗粒或MFe204 (M=Fe、 Zn、 Mn、 Co)颗粒。所述的分散相为环己烷或正庚烷和四氯乙烯的混合溶液。当分散相为正庚 烷和四氯乙烯的混合溶液时，正庚垸与四氯乙烯的体积比为2 4: 1。所述的复合表面活性剂为选自Tween系列表面活性剂(Tween-20、Tween-40、 Tween-60、 Tween-80和Tween-85)中的一种和选自Span系列表面活性剂 (Span國20、 Span-40、 Span-60、 Span-65、 Span-80、 Span-85)中的一种的混合 物，Tween表面活性剂与Span表面活性剂的质量比为1 5: 1 。所述的乙烯基化合物为甲基丙烯酰胺、N，N，-亚甲基双丙烯酰胺、甲基丙烯 酸縮水甘油酯和烯丙基縮水甘油醚的混合物。所述的磁性聚合物微球，可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转 苷酶、胰蛋白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特别适用于青霉素酰化酶 的固定化。青霉素酰化酶的固定化称取1克磁性聚合物微球置于25毫升锥形瓶中，加入用pH=7.5的lmol/L的磷酸钾缓冲液稀释至6毫升的1530IU的青霉素酰 化酶溶液，混合摇匀，在28。C的水浴摇床中固定72小时后，用去离子水和pH =7.5的0.1mol/L的磷酸钾缓冲液洗涤。固定化酶的表观活性测定(青霉素G钾盐水解制备6-APA):精确称取0.15 克固定化酶样品(湿重)置于反应器内，另取用50毫升0.02mol/L的磷酸二氢 钾缓冲溶液新配制的5% (W/V)青霉素G钾盐溶液，放入28'C恒温水浴中恒 温10分钟，然后将青霉素G钾盐溶液加入反应器，在搅拌条件下，用0.1mol/L 的NaOH溶液滴定，保持反应体系pH=8.0,反应10分钟，取后5分钟所消耗 NaOH溶液的体积，根据NaOH溶液用量来计算固定化酶的表观活性。A (IU/g) =VNaQHxCNaOHxl03/(mxt)其中，V他oH代表NaOH溶液的用量(ml)， C他oh代表NaOH溶液的浓度 (mol/L)本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于生物酶固定化的磁性聚合物微球，其特征在于，所述聚合物微球为具有核壳结构、超顺磁性、亲水性和含环氧基团的高分子聚合物珠状载体，即在纳米级磁性颗粒表面包覆含环氧基团的高分子聚合物。
【技术特征摘要】
1.用于生物酶固定化的磁性聚合物微球，其特征在于，所述聚合物微球为具有核壳结构、超顺磁性、亲水性和含环氧基团的高分子聚合物珠状载体，即在纳米级磁性颗粒表面包覆含环氧基团的高分子聚合物。2. 制备权利要求l所述的磁性聚合物微球的方法，其特征在于，为反 相悬浮聚合技术，包括如下步骤① 将复合表面活性剂溶解于分散相中，加热至45 ~ 75°C;② 将亲水性的纳米级磁性颗粒、乙烯基化合物溶解于曱酰胺中或甲醇和水 的混合物中，然后加入偶氮二异丁腈引发剂；③ 在氮气保护和强烈搅拌下，将步骤②的混合物转移到步骤①的溶液中进 行聚合反应，反应温度为45~75°C，反应时间为3一6小时，反应结束后， 通过外加磁场从反应体系中收集磁性聚合物微球。然后将磁性聚合物微球 经过乙醇洗涤、正庚烷浸泡和真空干燥后即可使用。3. 根据权利要求2所述的反相悬浮聚合技术，其特征在于，分散相与 乙烯基化合物的质量比为15~19: 1,复合表面活性剂的质量为乙烯基化 合物质量的15~20%,亲水性的纳米级磁性颗粒的质量为乙烯基化合物质 量的3~9%，偶氮二异丁腈的质量为乙烯基化合物质量的5-10%, M相 与曱酰胺或甲醇和水的混合物的体积比为5~10: 1。4. 根据权利要求2或3所述的反相悬浮聚合技术，其特征在于，亲水 性...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭杨龙，卢冠忠，朱秀艳，王筠松，王莹，詹望成，王艳芹，郭耘，刘晓晖，张志刚，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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