一种油茶花芽的石蜡切片及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种油茶花芽的石蜡切片及其制备方法和应用，所述方法包括取材分割与固定、第一脱水、第一透明处理、浸蜡、包埋、修蜡、切片、粘片、展片和烘片处理等操作步骤。利用本发明专利技术的方法制备得到的石蜡切片质量高、组织结构清晰完整、效果明显、可操作性强、可重复性高、实用性强；本发明专利技术提供的方法可以对不同发育时期的油茶花芽进行石蜡切片，进而观察整个油茶花发育过程。油茶花发育过程。油茶花发育过程。

【技术实现步骤摘要】
一种油茶花芽的石蜡切片及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于石蜡切片
，特别涉及一种石蜡切片及其制备方法和应用，尤其涉及一种油茶花芽的石蜡切片及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]油茶为(Camellia oleifera Abel.)山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)小乔木，原产于中国，与油棕、椰子、油橄榄被称为世界四大木本油料植物。油茶籽油富含不饱和脂肪酸、维生素E和山茶甙等特定生理活性物质，具有极高的食用和医疗保健价值，深受广大消费者的喜爱。
[0003]植物开花是植物形成经济产量的重要基础，油茶为雌雄同花，因其自交率极低，落花落果严重等问题，导致产量低下。通过对不同时期油茶花芽解剖结构的观察，能够发现油茶花芽生长发育的关键时期，以此为依据采取相应的栽培措施，有助于解决油茶生产上多花少果的问题。同时，油茶花芽的解剖结构研究还可以帮助鉴定种质资源，因此探索有效获得油茶花芽切片的方法在鉴定评价大量油茶种质时有重要的应用价值，有利于缩短油茶种质资源的鉴定周期。
[0004]石蜡切片是组织学中重要的试验技术之一，用于观察细胞及组织的形态结构，该技术广泛的运用于各学科领域的研究。石蜡切片基本步骤包括取样固定、软化、脱水、透明、浸蜡、包埋、修蜡、切片、展片、烘片、脱蜡、复水、染色、封片和观察等一系列处理，制作步骤较为繁杂，周期长，且每个步骤都很重要，不同组织结构的植物以及植物不同部位的组织所需的处理方法也有所差异。处理方法或操作出现问题都会影响切片质量，常出现材料破碎、切片不完整、蜡带不连续、存在空洞等问题。
[0005]油茶花芽因其组织结构密实，在脱水、浸蜡、切片等环节都存在困难，处理不当都容易造成切片破碎不完整、组织结构不清晰等问题，不利于观察。目前以油茶花芽为材料开展石蜡切片技术的研究较少，且切片效果不够理想，结构更为完整和清晰的油茶花芽切片尚未见报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种油茶花芽的石蜡切片及其制备方法和应用，利用本专利技术的方法制备得到的石蜡切片质量高、组织结构清晰完整、效果明显、可操作性强、可重复性高、实用性强；本专利技术提供的方法可以对不同发育时期的油茶花芽进行石蜡切片，进而观察整个油茶花发育过程。
[0007]为此，本专利技术技术方案如下：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种油茶花芽的石蜡切片制作方法，至少包括以下步骤：
[0009](1)取材分割与固定：摘取油茶花芽，剥除萼片，切除油茶花芽部分组织，固定并软化；
[0010](2)第一脱水和第一透明处理：将软化的油茶花芽依次采用梯度酒精进行脱水处
理；随后进行透明处理，所述透明剂至少包括正丁醇；
[0011]第一脱水的方式为依次采用体积浓度为70％、85％、95％的乙醇水溶液和无水乙醇浸泡，更换无水乙醇再浸泡，上述每次浸泡的时间分别为至少1h；
[0012](3)浸蜡：将透明油茶花芽先后浸入分析纯正丁醇
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石蜡混合液及纯石蜡溶液中浸泡；
[0013](4)将浸蜡油茶花芽依次经过包埋、修蜡、切片、粘片、展片和烘片处理；其中，油茶花芽切片蜡带的厚度优选为10
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15μm；所用粘片剂为新鲜鸡蛋清与分析纯甘油按体积比1：1配置；展片时间为至少30min，烘片时间为至少12h；
[0014](5)随后进行脱蜡、复水和染色处理；其中，脱蜡的具体方法为浸没于二甲苯溶液脱蜡20min，后更换二甲苯溶液脱蜡20min；脱蜡后的油茶花芽切片浸泡于复水剂中复水10min，得到预复水油茶花芽切片；复水剂为分析纯二甲苯和无水乙醇按体积比为1：1混合而成；将预复水油茶花芽切片依次采用无水乙醇、无水乙醇体积浓度为95％、85％、70％的乙醇水溶液浸泡复水，得到复水油茶花芽切片；随后浸入番红染色剂浸泡，再依次经体积浓度为85％、95％的乙醇水溶液浸泡，后使用固绿染色剂浸泡，得到染色油茶花芽切片；所述番红染色剂为1％番红溶液，溶质为番红或藏红粉末溶剂为体积浓度为50％的乙醇水溶液，所述固绿染色剂为1％固绿溶液，溶质为固绿粉末溶剂为体积浓度为95％的乙醇水溶液；
[0015](6)第二脱水和第二透明处理：将染色的油茶花芽依次采用梯度酒精进行脱水处理；随后进行透明处理，所述透明剂为二甲苯；
[0016](7)封片：使用中性树脂封片，烘干后得到油茶花芽的石蜡切片。
[0017]优选地，在步骤(1)中，纵向切除油茶花芽1/3
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1/5体积的组织；上述处理有利于花芽组织的固定、脱水、浸蜡等操作，使得溶液能够浸入花芽组织内部，同时有利于包埋时调整位置，切面朝下水平放置使得包埋时花芽始终是平行于包埋盒底面，切片时能够快速切到花芽中央包含雄蕊雌蕊等结构完整的纵截面，进而方便观察花芽内部细胞和组织结构的发育变化。由于油茶花芽结构紧密，固定和软化时进行多次抽真空处理有利于溶液充分浸入油茶花芽组织内部固定、软化细胞和组织，可防止细胞腐坏导致萎缩等形态结构的变化，进而保持细胞的完整性；
[0018]优选地，以切开后露出雄蕊的长度为标准：
[0019]对于小于1.1cm的油茶花芽(例如1.0cm、0.9cm、0.8cm、0.7cm、0.6cm、0.5cm等或所述范围内的所有取值，由于篇幅限制不再赘述)，纵向切除油茶花芽1/5体积的组织；
[0020]对于大于1.1cm的油茶花芽(例如1.1cm、1.2cm、1.3cm、1.4cm、1.5cm、1.6cm、1.7cm、1.8cm、1.9cm、2.0cm等或所述范围内的所有取值，由于篇幅限制不再赘述)，纵向切除油茶花芽1/3体积的组织；
[0021]长度小于0.5cm的油茶花芽(例如0.4cm、0.3cm、0.2cm、0.1cm等或所述范围内的所有取值，由于篇幅限制不再赘述)，不进行切割。
[0022]其中，固定液优选将分析纯甲醛溶液、冰醋酸和体积浓度为70％的乙醇水溶液按体积比为1：1：18配置；软化液是将体积浓度为70％的乙醇水溶液和分析纯甘油按体积比为1：1配置。
[0023]优选地，步骤(2)中所述透明处理具体为：
[0024]依次使用透明剂一和透明剂二浸泡脱水后的油茶花芽，至少更换3次，脱水后的油
茶花芽与透明剂溶液体积比大于1：10(例如可以是1：10、1：9.5、1：9、1：8.5、1：8、1：7.5、1：7、1：6.5、1：6、1：5.5、1：5或所述范围内的所有取值，由于篇幅限制不再赘述)；
[0025]其中，透明剂一为分析纯正丁醇和分析纯乙醇按体积比1：1混合的溶液；
[0026]透明剂二为分析纯正丁醇。本专利技术使用正丁醇作为透明剂进行透明处理，区别于传统的使用二甲苯作为透明剂，正丁醇毒性远低于二甲苯，作为透明剂使用后透明效果好，组织平整，没有明显的收缩、变形现象，且不存在透明操作时间过长导致材料变脆的问题，在保证切片结果的同时，很大程度上降低了二甲苯溶液对实验人员的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种油茶花芽的石蜡切片制作方法，其特征在于，至少包括以下步骤：(1)取材分割与固定：摘取油茶花芽，剥除萼片，切除油茶花芽部分组织，固定并软化；(2)第一脱水和第一透明处理：将软化的油茶花芽依次采用梯度酒精进行脱水处理；随后进行透明处理，所述透明剂至少包括正丁醇；(3)浸蜡：将透明油茶花芽先后浸入分析纯正丁醇
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石蜡混合液及纯石蜡溶液中浸泡；(4)将浸蜡油茶花芽依次经过包埋、修蜡、切片、粘片、展片和烘片处理；(5)随后进行脱蜡、复水和染色处理；(6)第二脱水和第二透明处理：将染色的油茶花芽依次采用梯度酒精进行脱水处理；随后进行透明处理，所述透明剂为二甲苯；(7)封片：使用中性树脂封片，烘干后得到油茶花芽的石蜡切片。2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，在步骤(1)中，纵向切除油茶花芽1/3
‑
1/5体积的组织；优选地，以切开后露出雄蕊的长度为标准：对于小于1.1cm的油茶花芽，纵向切除油茶花芽1/5体积的组织；对于大于1.1cm的油茶花芽，纵向切除油茶花芽1/3体积的组织；长度小于0.5cm的油茶花芽，不进行切割。3.根据权利要求1或2所述的制作方法，其特征在于，步骤(2)中所述透明处理具体为：依次使用透明剂一和透明剂二浸泡脱水后的油茶花芽，至少更换3次，脱水后的油茶花芽与透明剂溶液体积比大于1：10；其中，透明剂一为分析纯正丁醇和分析纯乙醇按体积比1：1混合的溶液；透明剂二为分析纯正丁醇。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的制作方法，其特征在于，步骤(3)中所述分析纯正丁醇石蜡混合液为提前在高温环境中融化混合完全的分析纯正丁醇石蜡混合液；优选地，所述高温环境的温度为75℃
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85℃；优选地，分析纯正丁醇与石蜡的质量体积比为1：1g/mL；优选地，步骤(3)浸泡完还包括以下步骤：置于55
‑
65℃环境中烘烤，然后用液体石蜡浸泡后得到浸蜡油茶花芽；优选地，所述液体石蜡的温度为55
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65℃。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的制作方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈金辉，孔令珊，王健，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：