含有AIF1细胞因子抗体的小球藻及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及含有AIF1细胞因子抗体的小球藻及其制备方法和应用。本发明专利技术采用纯化出来的近江牡蛎AIF1细胞因子抗体蛋白制品标记FITC荧光标记，以pVEC穿膜肽为载体将AIF1细胞因子抗体蛋白分子导入小球藻，在室温黑暗条件下，进行AIF1细胞因子抗体孵育小球藻，从而获得含有AIF1细胞因子抗体分子物质成分的小球藻种类。用抗体分子免疫荧光标记生物学技术、激光共聚焦显微镜检测、验证小球藻体内含有牡蛎AIF1细胞因子抗体蛋白质成分及其含量。其含量。其含量。

【技术实现步骤摘要】
含有AIF1细胞因子抗体的小球藻及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及含有AIF1细胞因子抗体的小球藻及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]“蓝色海洋产业”是当今人类解决人口过剩与陆地资源短缺这一矛盾的重要源泉，但随着海水养殖产业(包括贝类、虾类和鱼类养殖产业)的发展，海水养殖病害的暴发和流行给海水养殖产业的发展以极大的打击，成为这一产业发展的“瓶颈”制约因素。因此，人们迫切地需要解决下列两个重大的问题：即病害的“防”与“治(或曰控制)”，而解决“防”与“控制”的关键就是：一要解决流行病的快速检测问题，做到疾病暴发前的早诊断；二要解决养殖动物自身抵抗力的问题即免除病原感染，降低养殖动物群体的大规模死亡。国际上应用分子生物学技术(包括分子免疫学)防治海水养殖动物病害是当今国内外海水养殖病害研究的主攻发展方向，这些技术包括各种分子及免疫快速检测技术、各种分子疫苗技术、各种细胞或免疫因子、基因工程技术等。但是，目前国内外尚未有采用高效价细胞因子抗体技术来获得贝类、虾类和鱼类养殖产业生产中抗病的免疫饵料及抗菌微生态免疫制剂制备的技术和产品。
[0003]我们前期对AIF1对革兰氏阴性菌成份LPS和类立克次氏体(RLO)抗感染的研究显示：牡蛎AIF1(Ca
‑
AIF1)多克隆兔抗血清能显著抑制类立克次氏体(RLO)和LPS刺激引起的炎症相关因子LITAF的表达(LPS+anti
‑
Ca
‑
AIF1，1.5
‑
12小时分别降低70.95％，84.18％， 39.49％和87.53％；RLO+anti
‑
Ca
‑
AIF1，1.5
‑
12小时分别降低88.57％，84.80％，59.36％和 59.16％)，说明Ca
‑
AIF1多克隆抗血清具有有效抑制RLO感染和革兰氏阴性菌引起的炎症反应的作用。再比如，Ca
‑
AIF1抗血清能够显著抑制RLO感染和革兰氏阴性菌引起的细胞凋亡和细胞坏死，显著增加细胞存活率，RLO+anti
‑
Ca
‑
AIF1实验组和LPS+anti
‑
Ca
‑
AIF1实验组活细胞数分别增加了51％和49％；而晚期凋亡细胞率分别减少了约50％和18％。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术中存在的缺乏，本专利技术提供了含有AIF1细胞因子抗体驯化培养小球藻及其制备方法。
[0005]一种含有AIF1细胞因子抗体的小球藻。
[0006]含有AIF1细胞因子抗体的小球藻的制备方法，采用纯化出来的近江牡蛎AIF1细胞因子抗体蛋白制品标记FITC荧光标记，以pVEC穿膜肽为载体将AIF1细胞因子抗体蛋白分子导入小球藻，在室温黑暗条件下，进行AIF1细胞因子抗体孵育小球藻，从而获得含有AIF1细胞因子抗体的小球藻。
[0007]其中，AIF1细胞因子抗体的制备包括如下步骤：
[0008]1)以近江牡蛎血淋巴细胞总RNA为模板，反转录成一链cDNA，克隆获得AIF1基因的编码框核苷酸序列；
[0009]2)将AIF1基因编码框的序列片段克隆到pMD19
‑
T载体中，再经限制性内切酶酶切，与经同样酶切的pET
‑
32(a)原核表达载体连接，获得重组表达质粒pET
‑
32(a)
‑
AIF1；
[0010]3)将阳性重组质粒PET
‑
32(a)
‑
AIF1转化到表达宿主菌E.coli Rossetta(DE3)，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，SDS
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
‑
PAGE)进行检测；
[0011]4)将阳性表达菌液扩大培养，利用蛋白质纯化试剂盒分离纯化重组蛋白质；
[0012]5)将纯化的AIF1蛋白多点注射新西兰大白兔，制备纯化多克隆抗体。
[0013]AIF1细胞因子抗体蛋白分子导入小球藻包括如下步骤：
[0014]1.AIF1细胞因子抗体纯化及绿色荧光标记
[0015]1.1AIF1细胞因子多克隆抗体纯化
[0016]采用Protein A Sepharose亲和层析柱(索莱宝，中国)按照说明书纯化获得抗血清的总IgG。具体方法如下：使用Binding buffer(0.15M NaCl，20mM Na2HPO4，pH 7.0)调节血清至pH 7.0，上样至层析柱，依次用约10倍柱体积的Binding buffer(pH 7.0)洗除杂质，最后用洗脱buffer(100mmol/L甘氨酸，pH3.0)解吸附并收集蛋白，收集的蛋白立即用1.0 mol/L Tris
‑
HCl(pH 8.0)中和，
‑
20℃保存。
[0017]1.2纯化的AIF1细胞因子多克隆抗体荧光标记
[0018]使用NHS
‑
Fluorescein(Pierce，美国)标记纯化的AIF1多克隆抗体，步骤如下：取1ml 浓度为7.88mg/ml的纯化AIF1多克隆抗体转移至1.5ml无菌离心管中，加入37μl浓度为10mg/ml的NHS
‑
Fluorescein荧光溶液，4℃反应24h。反应完成后将反应产物装入透析袋(Viskase，美国)中置于1L PBS中透析(4度)，去除未结合度荧光素，换3次透析液，透析完全(透析外液为透明无色溶液)后取出偶联产物。稀释5倍后，分别测定A280 和A493吸光度值检测标记蛋白浓度和荧光标记率。
[0019]2.小球藻培养及生长曲线绘制
[0020]实验所用小球藻由广西壮族自治区海洋研究所馈赠，采用f/2培养液(225mg/L NaNO3， 5mg/L KH2PO4，100mg/LNaHCO3，200μg/L维生素B
12
，200μg/L维生素B1，)进行传代培养，将无菌小球藻按照1：10比例接种到新鲜培养基中，培养条件：温度23℃，光照强度3000lx，光暗周期比为12h：12h。每隔24h无菌条件下取藻样于酶标仪上测定660 nm处吸光值，绘制小球藻生长曲线，每个时间点执行3个生物学重复。
[0021]3.AIF1细胞因子抗体导入小球藻
[0022]收集处于对数生长期的小球藻并离心(400
×
g，10min)，使用无菌PBS 洗涤小球藻3次，使用细胞计数板显微镜下计数将浓度调整为106cell/mL，离心去掉上清液。将100μl终浓度为100μg/ml AIF1抗体与终浓度为20μM pVEC混合后加入藻沉淀中，使其浓度为106cell/mL。室温暗室中孵育，分别在孵育15min，30min时取样置于载玻片上， 50％甘油封片于共聚焦显微镜下观察拍照，每本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含有AIF1细胞因子抗体的小球藻。2.权利要求1所述含有AIF1细胞因子抗体的小球藻的制备方法，采用纯化出来的近江牡蛎AIF1细胞因子抗体蛋白制品标记FITC荧光标记，以pVEC穿膜肽为载体将AIF1细胞因子抗体蛋白分子导入小球藻，在室温黑暗条件下，进行AIF1细胞因子抗体孵育小球藻，从而获得含有AIF1细胞因子抗体的小球藻。3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于：AIF1细胞因子抗体的制备包括如下步骤：1)以近江牡蛎血淋巴细胞总RNA为模板，反转录成一链cDNA，克隆获得AIF1基因的编码框核苷酸序列；2)将AIF1基因编码框的序列片段克隆到pMD19
‑
T载体中，再经限制性内切酶酶切，与经同样酶切的pET
‑
32(a)原核表达载体连接，获得重组表达质粒pET
‑
32(a)
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AIF1；3)将阳性重组质粒PET
‑
32(a)
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AIF1转化到表达宿主菌E.coli Rossetta(DE3)，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，SDS
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聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
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PAGE)进行检测；4)将阳性表达菌液扩大培养，利用蛋白质纯化试剂盒分离纯化重组蛋白质；5)将纯化的AIF1蛋白多点注射新西兰大白兔，制备纯化多克隆抗体。4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于：AIF1细胞因子抗体蛋白分子导入小球藻包括如下步骤：1)AIF1细胞因子抗体纯化及绿色荧光标记采用Protein...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴信忠，蔡小辉，
申请(专利权)人：吴信忠，
类型：发明
国别省市：