检测水稻氮高效基因NRT1.1B的KASP分子标记及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测水稻氮高效基因NRT1.1B的KASP分子标记及其方法，所述分子标记是根据NRT1.1B基因编码区第980位的SNP位点设计的，命名为NRT1.1B

【技术实现步骤摘要】
检测水稻氮高效基因NRT1.1B的KASP分子标记及方法


[0001]本专利技术涉及一种检测水稻氮高效基因NRT1.1B的KASP分子标记及方法，属水稻育种


技术介绍

[0002]从上世纪50年代以来，化肥在农业生产中逐渐开始推广使用，使农作物的单位面积产量大幅增加。化肥的施用对粮食增产起了巨大的作用。在我国，化肥的施用对粮食增产的贡献率在40％左右，其中以氮肥的贡献率最大。1961年我国的水稻单产为2079kg/hm2，2017年水稻单产增加到6909kg/hm2，但同时氮肥的施用量增加了28倍(王吕与崔月贞等)。氮肥的过量使用给农田土壤和环境带来了严重的负面影响，破坏了农田生态系统的稳定性，成为了农业可持续发展的一个不利因素(张璐与黄晶等,2020)。
[0003]籼稻和粳稻是亚洲栽培稻的两个亚种。籼稻适合种植于热带和亚热带地区，粳稻适合种植于温带、寒带以及我国云贵高原等地区。籼稻和粳稻由于长期适应不同生态条件，两者在形态生理特性方面出现了明显的差异。已有研究表明，籼稻的氮肥利用效率显著的高于粳稻(Koutroubas and Ntanos,2003；殷春渊与张庆等,2010)。因此，如何利用籼稻中的基因资源，来选育氮肥利用效率高的粳稻品种，是一个长期挑战粳稻育种工作者的难题。Hu等(2015)的开创性的工作发现了水稻的氮利用效率与硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B相关(Hu and Wang et al.,2015)，为解决这一世界级难题打开了一条捷径。水稻生长过程中氮素的来源包括硝态氮和铵态氮。由于水稻根系周围存在根际硝化作用，灌溉水稻吸收的氮中有40％以硝态氮的形式被吸收(KRONZUCKER and GLASS et al.,2000)。研究发现籼稻和粳稻中的硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B出现了分化。其中籼稻中的等位基因NRT1.1B
‑
indica可以增强水稻根系对硝酸盐的吸收以及硝酸盐从根到地上部分的转运，将NRT1.1B
‑
indica等位基因引入到粳稻品种可以提高粳稻品种对氮肥的利用效率，以及提高产量。基因序列比较发现NRT1.1B基因编码区第980位碱基在粳稻中是一个C，而在籼稻为T，从而使NRT1.1B基因编码的蛋白的第327位氨基酸在粳稻和籼稻中分别为苏氨酸和蛋氨酸。这个SNP位点的差别赋予了籼稻更好的氮利用效率(Hu and Wang et al.,2015)。这一研究成果为氮高效水稻品种的选育提供了一个重要的基因资源。
[0004]为了开展氮高效粳稻品种的分子标记辅助育种工作，根据NRT1.1B基因编码区第980位SNP位点，两个不同的育种团队分别用四引物扩增受阻突变体系PCR(Tera
‑
primer Amplification Refractory Mutation System
‑
PCR,ARMS
‑
PCR)技术和等位基因特异PCR(Allele
‑
specific PCR，AS
‑
PCR)技术设计了NRT1.1B基因的功能性分子标记(田孟祥与余本勋等,2016；方琳与陶亚军等,2020)。此外，根据籼稻和粳稻NRT1.1B基因的内含子序列的比较，发现了6个Indel位点，根据这些Indel位点设计的Indel标记，也可以进行NRT1.1B基因型的鉴定(李军与李白,2016)。
[0005]竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR,KASP)是一种一步法的基因型鉴定技术，通过荧光信号判断目标位点的基因型。由于KASP标记具有省时省
力，费用低廉等特点，逐步成为了分子标记辅助育种中常用的标记类型(Steele and Quinton
‑
Tulloch et al.,2018；牛付安与周继华等,2019)。本研究根据NRT1.1B基因中的功能性SNP位点开发了一个KASP分子标记NRT1.1B
‑
KASP，可以准确地鉴定出NRT1.1B的基因型，为氮高效水稻新品种的分子标记辅助选择育种打下了基础。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是开发一个检测水稻氮高效基因NRT1.1B的KASP分子标记并应用于分子标记辅助选择育种，降低对大量样本进行NRT1.1B基因分子标记辅助选择的成本，提高育种效率。
[0007]为实现本专利技术目的，本专利技术提供了一种检测水稻氮高效基因NRT1.1B的KASP分子标记(NRT1.1B
‑
KASP)，其特征在于，所述NRT1.1B
‑
KASP分子标记的引物序列为：
[0008]Indica
‑
allele
‑
F：5
’‑
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGCCTCCACTTGCTCGCCA
‑3’
；
[0009]Japonica
‑
allele
‑
F：5
’‑
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGCCTCCACTTGCTCGCCG
‑3’
；
[0010]Common
‑
R：5
’‑
TCCTGGACCATGCGGCGATCAT
‑3’
。
[0011]另一方面，基于所述的KASP分子标记，本专利技术提供了检测水稻氮高效基因NRT1.1B的方法，包括以下步骤：
[0012]1)提取水稻待测样本的DNA；
[0013]2)采用NRT1.1B
‑
KASP分子标记对待测样本的基因组DNA进行目标序列的PCR扩增；所述NRT1.1B
‑
KASP分子标记的引物序列为：
[0014]Indica
‑
allele
‑
F：5
’‑
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGCCTCCACTTGCTCGCCA
‑3’
；
[0015]Japonica
‑
allele
‑
F：5
’‑
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGCCTCCACTTGCTCGCCG
‑3’
；
[0016]Common
‑
R：5
’‑
TCCTGGACCATGCGGCGATCAT
‑3’
；
[0017]3)对扩增后的样品进行基因分型检测，根据基因分型的结果判断样本材料中是否具有氮高效基因NRT1.1B。
[0018]所述Indica
‑
allele
‑
F的5'端为HEX荧光信号标签，HEX荧光信号标签序列为5'
‑
HEX
‑
GAAGGTCG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测水稻氮高效基因NRT1.1B的KASP分子标记，其特征在于，所述KASP分子标记(NRT1.1B
‑
KASP)的引物序列为：Indica
‑
allele
‑
F：5
’‑
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGCCTCCACTTGCTCGCCA
‑3’
；Japonica
‑
allele
‑
F：5
’‑
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGCCTCCACTTGCTCGCCG
‑3’
；Common
‑
R：5
’‑
TCCTGGACCATGCGGCGATCAT
‑3’
。2.检测水稻氮高效基因NRT1.1B的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取水稻待测样本的DNA；2)采用NRT1.1B
‑
KASP分子标记对待测样本的基因组DNA进行目标序列的PCR扩增；所述NRT1.1B
‑
KASP分子标记的引物序列为：Indica
‑
allele
‑
F：5
’‑
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGCCTCCACTTGCTCGCCA
‑3’
；Japonica
‑
allele
‑
F：5
’‑
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGCCTCCACTTGCTCGCCG
‑3’
；Common
‑
R：5
’‑
TCCTGGACCATGCGGCGATCAT
‑3’
；3)对扩增后的样品进...

【专利技术属性】
技术研发人员：周继华，储黄伟，程灿，曹黎明，牛付安，孙滨，涂荣剑，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：