评价筛选肠道抗炎抗氧化的中药提取物的体外模型及方法技术

本发明专利技术属于药物快速筛选评价方法的技术领域，更具体地，涉及评价筛选肠道抗炎抗氧化的中药提取物的体外模型及方法，其包括一种动物肠道炎症体外模型，模型构建方法依次包括中药提取物预处理、饥饿处理和刺激因子处理。基于该体外模型，本发明专利技术还提供了一种利用该体外模型快速筛选、评价中药提取物对动物肠道炎症的抗炎症反应和抗氧化应激药效的方法，包括提取模型细胞RNA，反转录为cDNA后使用RT

【技术实现步骤摘要】
评价筛选肠道抗炎抗氧化的中药提取物的体外模型及方法


[0001]本专利技术属于药物快速筛选评价方法的
更具体地，涉及评价筛选肠道抗炎抗氧化的中药提取物的体外模型及方法。

技术介绍

[0002]炎症反应是免疫系统应对外来病原或者伤害的自然抗病反应。在肠道炎症反应的发生过程中组织细胞会产生大量的炎性因子，炎性因子能引起肠道上皮细胞的损伤，而肠道上皮细胞过度损伤将导致动物发生严重的腹泻，并降低动物生产性能，甚至导致动物死亡。我国约有35％的动物腹泻是感染产肠毒素大肠杆菌(ETEC)所致，ETEC的细胞壁上的脂多糖(LPS)能诱发动物肠道炎症反应，从而导致动物腹泻的发生。为了降低动物在养殖过程中感染ETEC的风险，养殖户一般在饲料中添加药物以对动物进行预防性的疾病干预控制，其中以添加抗生素最为见效。然而，抗生素长期、大量的滥用，不仅使得抗生素在动物体内大量残留积累，还筛选出了耐药菌株，使得患病的动物无药可治，甚至还发生传染扩散的现象，造成养殖的动物大批量死亡，严重影响了养殖户的经济效益和我国养殖产业的发展。基于此，无抗生产成为了本领域的热门研究课题之一。
[0003]中药提取物是一种从天然植物中提取的药物活性组分，其包括多糖、生物碱、黄酮化合物和挥发油等物质，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、促生长等生物学功能。在当前无抗生产的大背景下，中药提取物替代抗生素添加至饲料中对动物进行喂养，能有效降低动物发生腹泻的风险，在养殖业中具有重要意义。然而中药提取物种类繁多，对ETEC感染导致的动物腹泻具有良好预防及治疗效果的中药提取物种类尚不明确，也没有较好的筛选方法。如中国专利申请CN104350142A公开了一种在体外模拟病理或生理性病况的方法，并利用该方法测试药物或化合物对于所述病理或生理性病况的效应，其建立了动脉和静脉血栓体外模型、动脉粥样硬化体外模型、高血压体外模型、体外肝模型、脂肪肝体外模型、可诱导多能干细胞衍生的人肝细胞系统，然而其中并不包括如何模拟动物肠道炎症的病况以及对应的药物测试方法。因此，迫切需要提供评价筛选肠道抗炎抗氧化的中药提取物的体外模型及方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是如何快速筛选具有抗动物肠道炎症效果的中药提取物并评价其药效，基于此，本专利技术提供评价筛选肠道抗炎抗氧化的中药提取物的体外模型及方法。
[0005]本专利技术第一目的是提供一种动物肠道炎症体外模型。专利技术人在经过长期、深入的研究后发现，动物肠道炎症反应还会引起肠上皮细胞的氧化应激：当动物发生肠道炎症反应时，组织细胞会分泌大量的TNF
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α和IL
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6，大量分泌的TNF
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α和IL
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6会破坏肠上皮细胞的氧化还原平衡，导致肠上皮细胞氧化应激的发生。基于这个发现，专利技术人针对炎症反应和氧化应激的发生原因，构建了一种动物肠道炎症体外模型，该体外模型模拟了动物长期食用
中药提取物后肠道上皮细胞发生炎症反应和氧化应激时的生理情况，有利于研究者对该中药提取物的药效进行定性评价与分析。
[0006]本专利技术第二目的是提供一种上述体外模型应用及应用方法。
[0007]提供以下描述以便于本领域技术人员理解本专利技术。
[0008]本专利技术所述“RNA”，系指核糖核苷酸。
[0009]本专利技术所述“cDNA”，系指在体外经过逆转录后与RNA互补的DNA链。
[0010]本专利技术所述“mRNA”，系指信使核糖核酸。
[0011]本专利技术所述“TNF
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α”，系指肿瘤坏死因子α，其是一种多效性细胞因子，TNF
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α的异常升高与炎症反应的发生有着重要的联系。
[0012]本专利技术所述“IL
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6”，系指白细胞介素
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6，其是一种多效性细胞因子，IL
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6水平的异常增高与炎症反应的发生存在重要的联系。
[0013]本专利技术所述“HO
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1”，系指血红素加氧酶
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1，其是一种氧化应激反应蛋白，在机体中可以将具有强氧化作用的血红素分解为CO、胆红素和铁，在氧化应激发生时HO
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1的表达对于抗氧化、维持正常氧化还原平衡状态有着重要的意义。
[0014]本专利技术所述“细胞株”，系指通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物。
[0015]本专利技术所述“DMEM/F12培养基”，系指DMEM培养基和F12培养基按体积比1:1混合得到的培养基。
[0016]本专利技术所述“FBS”，系指胎牛血清(Fetal Bovine Serum)。
[0017]本专利技术所述“双抗”，系指青链霉素混合液，其中青霉素G钠盐的工作浓度为100U/mL，硫酸链霉素的工作浓度为0.1mg/mL。
[0018]本专利技术所述“IPEC
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J2细胞”，系指一种特定的小鼠小肠上皮细胞。
[0019]本专利技术所述“种植”，系指将细胞悬液接种在培养介质表面的过程。
[0020]本专利技术所述“TRIZOL”，系指一种新型总RNA抽提试剂，可直接从细胞或组织中提取总RNA。
[0021]本专利技术所述“引物”，系指在核苷酸聚合作用起始时，与反应物以氢键形式连接、刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子。
[0022]本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
[0023]一种动物肠道炎症体外模型，其构建方法依次包括以下步骤：
[0024]S1、使用细胞培养基A培养载体细胞12
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24h；
[0025]S2、使用细胞培养基B培养载体细胞1
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12h；
[0026]S3、使用细胞培养基C培养载体细胞1
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6h，得到体外模型；
[0027]其中，所述载体细胞为动物肠道上皮细胞，所述细胞培养基A为含有待筛选中药提取物的细胞培养基D，所述细胞培养基B为不含FBS的细胞培养基D，所述细胞培养基C为含有LPS的细胞培养基D；所述细胞培养基D为DMEM培养基、F12培养基、DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基中的一种，且细胞培养基D含有FBS和双抗。
[0028]本专利技术通过使用中药提取物预处理载体细胞的方法，模拟了长期利用添加有对应中药提取物的饲料的动物的肠上皮细胞，同时通过使用饥饿培养载体细胞的方法，使得所有载体细胞同步处于G0期，从而实现了体外模型的高拟真度。特别的，考虑到ETEC引发动物
腹泻的关键在于其细胞壁上的LPS，而非是ETEC对动物肠上皮细胞的侵染或攻击行为，本专利技术通过使用外源性的LPS作为刺激因子对载体细胞进行诱导的方法，模拟了动物肠上皮细胞被ETEC感染时ETEC细胞壁上的LPS诱导动物肠上皮细胞发生炎症反应和氧化应激的情况。
[0029]本专利技术通过采用上述技术方案，成功地得到了一个中药提取物处理后的体外动物肠道本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种动物肠道炎症体外模型，其特征在于，所述模型的构建方法包括以下步骤：S1、使用细胞培养基A培养载体细胞12
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24h；S2、使用细胞培养基B培养载体细胞1
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12h；S3、使用细胞培养基C培养载体细胞1
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6h，得到体外模型；其中，所述载体细胞为动物肠道上皮细胞，所述细胞培养基A为含有待筛选中药提取物的细胞培养基D，所述细胞培养基B为不含FBS的细胞培养基D，所述细胞培养基C为含有LPS的细胞培养基D；所述细胞培养基D为DMEM培养基、F12培养基、DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基中的一种，且细胞培养基D含有FBS和双抗。2.根据权利要求1所述体外模型，其特征在于，所述步骤S1中的载体细胞取自预先使用细胞培养基D进行增殖培养的细胞株。3.根据权利要求1所述体外模型，其特征在于：所述细胞培养基A中的中药提取物的浓度为10
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40μg/mL。4.根据权利要求1所述体外模型，其特征在于：所述细胞培养基C中的LPS的浓度为30
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓曦，谢玉萍，许业男，谷风柱，鲍明隆，梁梅，孙心怡，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：