一种拮抗烟草靶斑病病原菌的菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种拮抗烟草靶斑病病原菌的菌株，所述菌株为铜绿假单胞菌GT

【技术实现步骤摘要】
一种拮抗烟草靶斑病病原菌的菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及菌株筛选
，更具体地说是涉及一种拮抗烟草靶斑病病原菌的菌株及其应用。

技术介绍

[0002]烟草靶斑病是由瓜亡革菌引起的一种真菌性病害。烟草靶斑病从苗期至烟叶成熟时均可发生，既侵染叶片，也危害茎部。侵染叶片初为圆形水渍状斑点，如温度较高、湿度大、叶片湿润时间较长，则病斑迅速扩展，形成直径2
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20cm的不规则斑，有同心轮纹，形成褪绿晕圈枯斑，病斑坏死部分易碎形成穿孔，形似枪弹射击后留下在靶子上的空洞，故称靶斑病。湿度较大时在叶片下表面的病斑边缘常产生该菌的菌丝体及有性世代的子实层和担孢子。
[0003]目前，烟草靶斑病的防治措施主要是化学农药防治，但是，使用化学药剂进行防治会有农药残留，严重污染环境且对人畜也有危害，并且长期使用同种化学农药会让植株产生一定的抗药性，防治效果会大大打折扣。而生物防治不会对环境产生污染，也不会危害人畜健康，且能有效防治该病害的传播。
[0004]因此，如何提供一种可以拮抗烟草靶斑病病原菌的菌株是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种拮抗烟草靶斑病病原菌的菌株，并将该菌株应用于防治烟草靶斑病中。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种拮抗烟草靶斑病病原菌的菌株，所述菌株为铜绿假单胞菌GT
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6，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年7月30日，保藏编号为CCTCC NO：M 2021953，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，分类学命名为Pseudomonas aeruginosa GT
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6。
[0008]上述拮抗烟草靶斑病病原菌的菌株在防治烟草靶斑病中的应用。
附图说明
[0009]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0010]图1附图为本专利技术提供的GT
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6菌株与立枯丝核菌的对峙培养结果图；
[0011]图2附图为本专利技术提供的GT
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6菌株对立枯丝核菌菌丝的抑菌效果图；
[0012]图3附图为本专利技术提供的GT
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6菌株的菌落形态图；
[0013]图4附图为本专利技术提供的GT
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6菌株的16S rDNA PCR产物凝胶电泳图；
[0014]图5附图为本专利技术提供的GT
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6菌株的同源性比对结果图；
[0015]图6附图为本专利技术提供的GT
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6菌株的系统发育树结果图。
具体实施方式
[0016]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0017]实施例中用到的材料、试剂和仪器：
[0018]烟草根际土壤：从湖南省张家界市、永顺县、龙山县、石门县和慈利县的5个烟区烟草靶斑病发生严重的烟田里采集的烟苗根部的土壤。
[0019]培养基与药剂
[0020]LB培养基：利用电子天平称取蛋白胨10g、酵母粉5g和NaCl 10g，加入500ml的去离子水，用玻璃棒搅拌使药品全部溶解，再加入去离子水定容至1L，将1L的培养基分装在500ml的锥形瓶中，每瓶加入200ml，再在锥形瓶中加入1.5g的琼脂，经高压蒸汽灭菌锅在121℃下湿热灭菌25min，配置成LB固体培养基，冷却备用；
[0021]LB液体培养基：配置方法同上，但是不加琼脂，将培养基分装于50ml锥形瓶中，每瓶分装20ml，于高压蒸汽灭菌锅在121℃下湿热灭菌25min。配置成LB液体培养基；
[0022]药剂：蛋白胨、酵母粉、Nacl、琼脂粉、CTAB、无水乙醇、苯酚
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氯仿
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异戊醇(25:24:1)、氯仿、异丙醇、无菌水等；
[0023]实验仪器
[0024]2L量筒、玻璃棒、2ml离心管、15ml离心管、移液枪、涂布棒、一次性培养皿、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、摇床等。
[0025]实施例1菌株筛选
[0026]1)取样
[0027]从湖南各烟区烟田烟草靶斑病发生严重的烟田中连根挖取健康的烟苗，将烟苗装入灭过菌的纸袋子中保存，带回实验室后，将烟草根部的土抖落下来，将粗土过筛留下细土。
[0028]2)土壤悬浮液制备
[0029]称取土样0.1g于15ml离心管中，加入9.9ml的无菌水，制成10
‑2g/ml的土壤悬浮液，利用1ml的移液枪取浓度为10
‑2g/ml的土壤悬浮液于9ml的无菌水中，制成10ml浓度为10
‑3g/ml的土壤悬浮液，按照此方法继续将土壤悬浮液进行稀释，获得浓度为10
‑6g/ml、10
‑7g/ml和10
‑8g/ml的土壤悬浮液，取这三种浓度的悬浮液各200ul，分别加入到PDA培养基和LB培养基上进行涂布分菌，每个浓度的悬浮液涂三个培养皿，将涂布完的PDA培养皿放在28℃培养箱中，涂布完的LB培养皿放在37℃的培养箱中，两种不同培养基的培养皿都倒置培养。一段时间后观察在不同稀释浓度下菌株长势，筛选出的细菌挑选出合适的单菌落进行划线纯化，筛选出的真菌是挑取菌丝或者在单菌落边缘打菌饼进行纯化，对分离得到的菌株进行编号，并于4℃保存，用于下一步拮抗实验鉴定。共分离得到33株菌株，其中细菌23株，真菌7株和放线菌3株。
[0030]3)生防菌的筛选
[0031]以烟草靶斑病病菌(R.solani)为靶标，将从烟草根际土壤分离出的菌株与Rsolani进行对峙培养，具体步骤为：将活化后的烟草靶斑病病菌打菌饼接种在PDA培养皿上，位置靠培养皿边缘约1cm，再将筛选出的细菌和真菌接种在Rsolani的正对面，距离PDA培养皿边缘也是约1cm处。筛选出来的细菌和放线菌接种是利用划线产生的单菌落进行，利用灭菌的牙签将单菌落接种在Rsolani对面，筛选出来的真菌是按照打菌饼的方式，在真菌菌落边缘打菌饼，再接种到Rsolani对面。将筛选出的微生物按照此类方法全部与R.solani进行对峙培养，每种菌接三个重复，同时接种无菌的PDA菌饼及点无菌水作为对照组，将接种完的PDA培养皿放在28℃的培养箱中培养，培养一段时间后进行观察。筛选出对烟草靶斑病病菌菌丝的生长有明显的抑制效果的生防细菌，编号分别为GT
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6，结果见图1；
[0032]4)生防菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种拮抗烟草靶斑病病原菌的菌株，其特征在于，所述菌株为铜绿假单胞菌GT
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6，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年7月30日，保藏编号为CCTCC NO：M 2021953，保...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐前君，刘天波，肖艳松，肖志鹏，周向平，滕凯，巢进，蔡海林，李玲玲，曹明锋，曾维爱，
申请(专利权)人：中国烟草中南农业试验站，
类型：发明
国别省市：