一种高纯人凝血酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高纯人凝血酶的制备方法，属于生物制药领域。本发明专利技术从去冷沉淀人血浆中提取人凝血酶的方法，包括新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀；DEAE Sephadex A

【技术实现步骤摘要】
一种高纯人凝血酶的制备方法


[0001]本专利技术属于生物制药领域，涉及血液制品的提取工艺，特别涉及一种人凝血酶的提取方法。

技术介绍

[0002]人凝血酶是丝氨酸蛋白酶，分子量约37kd，白色无定形粉末，溶于水，不溶于有机溶剂。包含有两条由二硫键连接的两条链，轻链和重链的分子量分别为6000和31000，其活性部位在重链上。因为在血浆中存在高浓度的抗凝血酶，凝血酶只能存在几分钟，它是以凝血酶原的形式存在于血浆中，凝血酶原的含量很少，在正常血浆中含量在0.11～0.30mg/mL。因子Xa、V、钙离子和磷脂形成“凝血酶原酶复合物”，它是由凝血酶原在凝血酶原酶复合物的作用下，分别在精氨酸274一苏氨酸275和精氨酸323一异亮氨酸324两肽键处先后断裂形成的。因子Xa是此复合物的活性中心，单独因子Xa也能缓慢裂解凝血酶原。因子V经凝血酶和因子Xa激活成Va，比因子V活性更强，在激活凝血酶原的过程中起辅助因子作用。钙离子将因子Xa和凝血酶原连接于磷脂，Va通过其疏水区也连接与磷脂，磷脂的主要作用是提供活性表面。
[0003]凝血酶为止血药，临床上主要适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管以及实质性脏器出血的止血；用于外伤、手术、口腔、耳、鼻、喉、泌尿、烧伤、骨科、神经外科、眼科、妇产科以及消化道等部位出血的止血。凝血酶直接作用于血液凝固过程的最后一步，促使血浆中的可溶性纤维蛋白原转变成不溶的纤维蛋白，从而达到速效止血的目的。而且还能促进上皮细胞的有丝分裂，加速创伤愈合，是一种速效的局部止血药。凝血酶适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管、实质性脏器的出血及其他各种出血。
[0004]凝血酶局部止血效果好，且无副作用。目前凝血酶的应用范围正日渐扩大，由单纯的局部外敷发展到外科手术、耳鼻喉、口腔、妇产、泌尿及消化道等部位出血止血，亦可作为多种外用止血药物的重要原料，将广泛应用于临床。同时，除了传统的凝血作用外，凝血酶在脑血管病中的作用也日益受到重视，目前的研究表明，凝血酶不仅在脑出血、脑缺血中有毒性作用，在中枢神经系统正常发育和损伤保护中也有重要作用。临床研究体现出小剂量可产生神经保护作用，而大剂量则具有细胞毒性作用。因此，由于该药临床使用日渐广泛，将使目前十分紧俏的凝血酶更趋紧缺，生产前景看好。
[0005]目前常见的血浆中人凝血酶提取工艺为层析法，原料为去冷沉淀血浆或Cohn组分Ⅲ。国内现有相关专利技术专利两种原料提取工艺均有涉及，如专利《一种人凝血酶的制备方法》(申请号201610614283.8)，工艺为Cohn组分Ⅲ复溶、病毒灭活、阴离子交换层析、加入钙离子激活、阳离子交换层析、纳滤；专利《一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法》(申请号201510586400.X)，工艺为阴离子树脂吸附去冷胶血浆中凝血酶原，洗脱过滤得凝血酶原溶液，加入氯化钙溶液激活得凝血酶溶液，S/D病毒灭活，阳离子层析得纯化凝血酶溶液，再经过超滤透析浓缩，纳滤，除菌过滤，分装冻干，干热灭活得人凝血酶成品；专利《制备冻干人凝血酶的方法》(申请号201510520812.3)，工艺为以Cohn组分Ⅲ为原料，经等电点沉淀法
制的人凝血酶原，氯化钙激活得人凝血酶粗品，S/D病毒灭活，SP
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Sephadex C
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50层析纯化得精制的人凝血酶，再经过超滤浓缩，添加稳定剂，纳滤，除菌过滤，冻干和干热得目标物。
[0006]本专利技术开发一种新的优化工艺提取人凝血酶，开发出适合于工业生产规模的人凝血酶制剂制备工艺，具有稳定性好，纯度高，病毒去除效果更好的特点的人凝血酶提取工艺。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人凝血酶的提取方法，所制得的人凝血酶制剂纯度高，稳定性高，病毒灭活效果好。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]一种高纯人凝血酶的制备方法，包括如下步骤：
[0010](1)新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀：将新鲜冰冻人血浆融化混合均匀后，经过流式离心机去除冷沉淀，取得离心后的血浆上清液；
[0011](2)DEAE Sephadex A
‑
50凝胶吸附：在步骤(1)所得到的血浆上清液中加入DEAE Sephadex A
‑
50凝胶，干凝胶的加入量为0.5
‑
1.5g/kg料液，干凝胶预先用70℃以上热注射用水进行溶胀，再用25℃以下冷注射用水进行冷却，最后用平衡缓冲液平衡，适当转速(确保凝胶在溶液中混合分布均匀同时不宜太快)搅拌1.0
‑
2.0小时，收集凝胶，采用平衡缓冲液洗涤5次左右，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液并用0.45μm滤芯过滤，凝胶经过再生后保存可以重复使用；
[0012](3)超滤：将步骤(2)所得的滤液先超滤浓缩，将洗脱液Ⅱ因子效价调整至5
‑
20IU/mL，通过透析将电导调整至0.5
‑
4.5ms/cm；
[0013](4)激活：将步骤(3)所得料液进行除菌过滤，调整pH至6.5
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7.5，然后再将配好的氯化钙母液经过除菌过滤后按比例加入料液中，使钙离子浓度保持在30
‑
80mM，2
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8℃激活5
‑
15天；
[0014](5)压滤：向步骤(4)所得激活后悬浮液按5
‑
20g硅藻土/kg料液比例添加硅藻土，三分之一硅藻土预铺板框，其余加入料液中，压滤收集上清液，用0.45μm滤芯进行过滤；
[0015](6)S/D病毒灭活：温和搅拌下将S/D灭活液缓慢加入步骤(5)所得滤液中，添加完毕后，搅拌15
‑
30min，添加时间≤30min，调整液温至24
‑
26℃，灭活6小时，每30min记录一次温度；
[0016](7)离子交换层析：离子交换层析柱先用平衡液充分平衡，将步骤(6)所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用洗涤缓冲液冲10个左右柱体积，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，然后用稀释液调整凝血酶效价约500IU/mL；
[0017](8)除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；
[0018](9)纳米膜除病毒过滤：先用0.1μm滤芯预过滤，再用15纳米滤芯进行除病毒过滤；
[0019](10)分装；
[0020](11)冷冻干燥：采取预冷，速冻、退火及一次干燥与二次干燥，最后得到人凝血酶冻干粉。
[0021]所述步骤(2)中所述的DEAE Sephadex A
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50凝胶吸附，采用的是本公司的血浆吸附过滤装置(中国专利技术专利CN201810248696.8一种用于凝血因子类血液制品生产的血浆吸
附过滤装置)。
[0022]所述步骤(2)中所述的平衡缓冲液配方为：0.01
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0.02M枸橼酸钠，0.15
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高纯人凝血酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀：将新鲜冰冻人血浆融化混合均匀后，经过流式离心机去除冷沉淀，取得离心后的血浆上清液；(2)DEAE Sephadex A
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50凝胶吸附：在步骤(1)所得到的血浆上清液中加入DEAE Sephadex A
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50凝胶，干凝胶的加入量为0.5
‑
1.5g/kg料液，干凝胶预先用70℃以上热注射用水进行溶胀，再用25℃以下冷注射用水进行冷却，最后用平衡缓冲液平衡，适当转速(确保凝胶在溶液中混合分布均匀同时不宜太快)搅拌1.0
‑
2.0小时，收集凝胶，采用平衡缓冲液洗涤5次左右，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液并用0.45μm滤芯过滤，凝胶经过再生后保存可以重复使用；(3)超滤：将步骤(2)所得的滤液先超滤浓缩，将洗脱液Ⅱ因子效价调整至5
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20IU/mL，通过透析将电导调整至0.5
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4.5ms/cm；(4)激活：将步骤(3)所得料液进行除菌过滤，调整pH至6.5
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7.5，然后再将配好的氯化钙母液经过除菌过滤后按比例加入料液中，使钙离子浓度保持在30
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80mM，2
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8℃激活5
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15天；(5)压滤：向步骤(4)所得激活后悬浮液按5
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20g硅藻土/kg料液比例添加硅藻土，三分之一硅藻土预铺板框，其余加入料液中，压滤收集上清液，用0.45μm滤芯进行过滤；(6)S/D病毒灭活：温和搅拌下将S/D灭活液缓慢加入步骤(5)所得滤液中，添加完毕后，搅拌15
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30min，添加时间≤30min，调整液温至24
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26℃，灭活6小时，每30min记录一次温度；(7)离子交换层析：离子交换层析柱先用平衡液充分平衡，将步骤(6)所得料液用0...

【专利技术属性】
技术研发人员：庾昌文，何甜，王振国，刘国维，
申请(专利权)人：广东双林生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：