基因组编辑系统和方法技术方案

本发明专利技术涉及基因工程领域。具体而言，本发明专利技术涉及新的基因组编辑系统和方法。更具体而言，本发明专利技术涉及新的能够对细胞基因组进行高效编辑的CRISPR

【技术实现步骤摘要】
基因组编辑系统和方法
[0001]本申请是申请日为2017年12月27日的第201780035094.8号专利技术名称为“基因组编辑系统和方法”的中国专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及基因工程领域。具体而言，本专利技术涉及新的基因组编辑系统和方法。更具体而言，本专利技术涉及新的能够对细胞基因组进行高效编辑的CRISPR
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C2c1系统及其用途。

技术介绍

[0003]CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，成簇的规律间隔的短回文重复序列)系统是细菌在进化过程中产生的用于防御外来基因入侵的免疫系统。其中，II型CRISPR
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Cas9系统是通过两个小RNA(crRNA和tracrRNA)或者一个人工合成小RNA(sgRNA)介导一个Cas9蛋白进行DNA切割的系统，也是最早发现的三种(I、II、III型)CRISPR系统中最简单的系统。由于该系统简单易操作，在2013年被改造并成功实现了真核生物基因组的编辑。CRISPR/Cas9系统迅速成为了生命科学领域最热门的技术。
[0004]2015年，Zhang et al.通过序列比对和系统分析的方法又发现了区别于CRISPR
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Cas9系统之外的新的V
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A型基因组编辑系统，即CRISPR
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Cpf1系统。该系统只需要一个小RNA(crRNA)的介导即可实现基因组的编辑。
[0005]2015年，Shmakov等人还鉴定出新的基因组编辑系统(Molecular Cell 60,385
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397,November 5,2015)：C2c1(V
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B)、C2c2(VI)和C2c3(V
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C)系统。其中来自Alicyclobacillus acidoterrestris的AacC2c1被证实可以实现DNA切割，然而其活性受到例如温度的限制。AacC2c1系统在低于40℃无法切割DNA。并且，没有证明AacC2c1系统能够在真核生物中实现基因组编辑
[0006]为了更便利地进行基因编辑，本领域仍然需要更多能够实现高效基因组编辑的系统。
[0007]专利技术简述
[0008]本专利技术人鉴定出一种新的CRISPR
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C2c1系统，其可进行哺乳动物细胞的基因组编辑。本专利技术所鉴定的C2c1核酸酶在体外实验中具有耐高温、耐酸碱的特性。并且，本专利技术对所鉴定的CRISPR
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C2c1系统的sgRNA进行了优化，使其长度大大缩短，而不影响其打靶效率。最后，本专利技术人还对所鉴定的C2c1蛋白本身进行改造，使其从核酸内切酶变成死亡的C2c1(dC2c1)，扩展了其用途。
[0009]在一方面，本专利技术提供了一种用于对细胞基因组中的靶序列进行定点修饰的基因组编辑系统，其包含以下i)至v)中至少一项：
[0010]i)C2c1蛋白或其变体，和向导RNA；
[0011]ii)包含编码C2c1蛋白或其变体的核苷酸序列的表达构建体，和向导RNA；
[0012]iii)C2c1蛋白或其变体，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
[0013]iv)包含编码C2c1蛋白或其变体的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码向导RNA
的核苷酸序列的表达构建体；
[0014]v)包含编码C2c1蛋白或其变体的核苷酸序列和编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
[0015]其中所述向导RNA能够与所述C2c1蛋白或其变体形成复合物，将所述C2c1蛋白或其变体靶向所述细胞基因组中的靶序列，导致所述靶序列中的一或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加。在一些实施方案中，所述C2c1蛋白是来自Alicyclobacillus acidiphilus或Alicyclobacillus kakegawensis的C2c1蛋白。
[0016]在另一方面，本专利技术提供了一种对细胞基因组中的靶序列进行定点修饰的方法，包括将本专利技术的基因组编辑系统导入所述细胞。
[0017]在另一方面，本专利技术提供了一种治疗有需要的对象中的疾病的方法，包括向所述对象递送有效量的本专利技术的基因组编辑系统以修饰所述对象中与所述疾病相关的基因。
[0018]在另一方面，本专利技术提供了本专利技术的基因组编辑系统在制备用于治疗有需要的对象中的疾病的药物组合物中的用途，其中所述基因组编辑系统用于修饰所述对象中与所述疾病相关的基因。
[0019]在另一方面，本专利技术提供了一种用于治疗有需要的对象中的疾病的药物组合物，其包含本专利技术的基因组编辑系统和药学可接受的载体，其中所述基因组编辑系统用于修饰所述对象中与所述疾病相关的基因。
[0020]附图描述
[0021]图1和图2示出了AaC2c1核酸酶活性的体外分析结果。
[0022]图3和图4示出了AaC2c1和AkC2c1在哺乳动物细胞中的基因组编辑活性。
[0023]图5和图6示出了对指导AaC2c1基因组编辑的单向导RNA(sgRNA)进行优化。
[0024]图7示出了靶序列长度和错配度对AaC2c1编辑活性的影响。
[0025]图8示出了对AaC2c1的脱靶效应分析。
[0026]图9示出了AaC2c1的关键催化残基的鉴定和突变分析。
[0027]图10示出不同物种来源C2c1蛋白的序列比对和结构分析。
[0028]专利技术详述
[0029]在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本专利技术中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(下文称为“Sambrook”)。
[0030]在一方面，本专利技术提供了一种用于对细胞基因组中的靶序列进行定点修饰的基因组编辑系统，其包含以下i)至v)中至少一项：
[0031]i)C2c1蛋白或其变体，和向导RNA；
[0032]ii)包含编码C2c1蛋白或其变体的核苷酸序列的表达构建体，和向导RNA；
[0033]iii)C2c1蛋白或其变体，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
[0034]iv)包含编码C2c1蛋白或其变体的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码向导RNA
的核苷酸序列的表达构建体；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于对细胞基因组中的靶序列进行定点修饰的基因组编辑系统，其包含以下i)至v)中至少一项：i)C2c1蛋白或其变体，和向导RNA；ii)包含编码C2c1蛋白或其变体的核苷酸序列的表达构建体，和向导RNA；iii)C2c1蛋白或其变体，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；iv)包含编码C2c1蛋白或其变体的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；v)包含编码C2c1蛋白或其变体的核苷酸序列和编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；其中所述向导RNA能够与所述C2c1蛋白或其变体形成复合物，将所述C2c1蛋白或其变体靶向所述细胞基因组中的靶序列，导致所述靶序列中的一或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加，其中所述C2c1蛋白是来自Alicyclobacillus acidiphilus的AaC2c1蛋白或者来自Alicyclobacillus kakegawensis的AkC2c1蛋白，其中所述AaC2c1蛋白由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成，或者所述AaC2c1蛋白的变体包含与SEQ NO:1具有至少80％序列相同性的氨基酸序列并且具有野生型AaC2c1蛋白的RNA介导的DNA结合活性和/或DNA切割活性，并且其中所述AkC2c1蛋白由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成，或者所述AkC2c1蛋白的变体包含与SEQ NO:5具有至少80％序列相同性的氨基酸序列并且具有野生型AkC2c1蛋白的RNA介导的DNA结合活性和/或DNA切割活性。2.权利要求1的系统，其中所述AaC2c1蛋白的变体相对于SEQ ID NO:1所示的野生型AaC2c1蛋白包含氨基酸取代R785A并且具有野生型AaC2c1蛋白的RNA介导的DNA结合活性和/或DNA切割活性。3.权利要求1或2的系统，其中所述AaC2c1蛋白的变体是核酸酶死亡的AaC2c1和脱氨酶的融合蛋白，所述脱氨酶是能够接受单链DNA作为底物的胞嘧啶脱氨酶或能够接受单链DNA作为底物的腺嘌呤脱氨酶。4.权利要求3的系统，其中所述核酸酶死亡的AaC2c1在相对于SEQ ID NO:1所示的野生型AaC2c1蛋白的第785位的氨基酸被取代。5.权利要求4的系统，其中所述核酸酶死亡的AaC2c1相对于SEQ ID NO:1所示的野生型AaC2c1蛋白包含氨基酸取代R785A。6.权利要求1的系统，其中所述向导RNA是sgRNA。7.权利要求6的系统，所述sgRNA由选自以下之一的核酸序列编码：5
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【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，周琪，滕飞，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：