用于分离无细胞DNA的组合物和方法技术

本文公开了用于分离DNA诸如无细胞DNA(cfDNA)的组合物和方法。在一些实施方案中，无细胞DNA来自具有或疑似具有癌症的受试者，和/或无细胞DNA包括由肿瘤产生的DNA。在一些实施方案中，通过该方法分离的DNA使用序列可变靶区组(a sequence

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于分离无细胞DNA的组合物和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年1月31日提交的美国临时专利申请第62/799,637号的优先权的权益，该申请出于所有目的通过引用并入本文。
[0003]背景
[0004]癌症每年导致全世界数百万人死亡。癌症的早期检测可能导致改进的结果，因为早期癌症倾向于对治疗更敏感。
[0005]不当控制的细胞生长是癌症的标志(hallmark)，癌症通常由遗传改变和表观遗传改变诸如拷贝数变异(CNV)、单核苷酸变异(SNV)、基因融合体、插入和/或缺失(插入缺失(indels))的积累引起，表观遗传变异包括胞嘧啶的5
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甲基化(5
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甲基胞嘧啶)以及DNA与染色质蛋白和转录因子的缔合。
[0006]活检代表了用于检测或诊断癌症的传统方法，其中从可能的癌症部位提取细胞或组织，并分析相关的表型和/或基因型特征。活检具有侵入性的缺点。
[0007]基于体液诸如血液分析的癌症检测(“液体活检”)是基于对来自癌细胞的DNA被释放到体液中的观察结果的有趣的替代方法。液体活检是非侵入性的(可能仅需要抽血)。然而，考虑到无细胞DNA的低浓度和异质性，开发用于分析液体活检材料的准确且灵敏的方法是有挑战的。分离可用于液体活检程序中进一步分析的无细胞DNA级分是该过程的重要部分。因此，对于用于分离无细胞DNA(例如用于液体活检)的改进的方法和组合物存在需求。
[0008]概述
[0009]本公开内容提供了用于分离DNA，诸如无细胞DNA的组合物和方法。本公开内容部分地基于以下认识。分离无细胞的DNA以便捕获两个靶区组——序列可变靶区组和表观遗传靶区组(其中序列可变靶区组的捕获产量大于表观遗传靶区组的捕获产量)可能是有益的。在本文描述的涉及序列可变靶区组和表观遗传靶区组的所有实施方案中，序列可变靶区组包括表观遗传靶区组中不存在的区域，并且反之亦然，尽管在一些情况下，区域的级分可以重叠(例如，基因组位置的级分可以在两个靶区组中呈现)。捕获产量的差异可以允许例如在同时测序期间诸如在同一测序池(sequencing cell)中或在同一待测序材料池中在序列可变靶区组中进行深度且因此更准确的序列确定，以及在表观遗传靶区组中进行浅且更广泛的覆盖。
[0010]表观遗传靶区组可以以各种方式进行分析，包括不依赖于靶内特定核苷酸序列确定中的高度准确度的方法。实例包括确定甲基化和/或片段的分布和尺寸，这可以指示获得片段的细胞中正常或异常的染色质结构。这样的分析可以通过测序来执行，并且与确定序列突变(诸如碱基取代、插入或缺失)的存在或不存在相比，需要更少的数据(例如，序列读段的数量或测序覆盖的深度)。
[0011]与本文描述的方法相比，以相同的捕获产量分离表观遗传靶区组和序列可变靶区组将导致表观遗传靶区组不必要的冗余数据的产生和/或提供比确定序列可变靶区组成员的基因型所期望的更低的准确度。
[0012]本公开内容旨在满足对于改进无细胞DNA分离的需求和/或提供其他益处。因此，
提供了以下示例性实施方案。
[0013]在一方面，本公开内容提供了一种分离无细胞DNA(cfDNA)的方法，该方法包括：捕获从测试受试者获得的cfDNA的多于一个靶区组，其中多于一个靶区组包括序列可变靶区组和表观遗传靶区组，从而产生捕获的cfDNA分子组；其中在捕获的cfDNA分子组中，对应于序列可变靶区组的cfDNA分子以比对应于表观遗传靶区组的cfDNA分子更高的捕获产量被捕获。
[0014]在另一方面，本公开内容提供了一种分离无细胞DNA(cfDNA)的方法，该方法包括：使从测试受试者获得的cfDNA与靶特异性探针组接触，其中靶特异性探针组包括对序列可变靶区组特异性的靶结合探针和对表观遗传靶区组特异性的靶结合探针，并且靶特异性探针组被配置为以比对应于表观遗传靶区组的cfDNA更高的捕获产量捕获对应于序列可变靶区组的cfDNA，从而形成靶特异性探针和cfDNA的复合物；并且将复合物与未与靶特异性探针结合的cfDNA分开，从而提供捕获的cfDNA分子组。在一些实施方案中，该方法还包括对捕获的cfDNA分子组进行测序。在一些实施方案中，该方法还包括将对应于序列可变靶区组的cfDNA分子测序至比对应于表观遗传靶区组的cfDNA分子更深的测序深度。
[0015]在另一方面，本公开内容提供了一种鉴定由肿瘤产生的DNA的存在的方法，该方法包括：从测试受试者收集cfDNA，从cfDNA中捕获多于一个靶区组，其中多于一个靶区组包括序列可变靶区组和表观遗传靶区组，从而产生捕获的cfDNA分子组，对捕获的cfDNA分子进行测序，其中序列可变靶区组的捕获的cfDNA分子被测序至比表观遗传靶区组的捕获的cfDNA分子更深的测序深度。
[0016]在另一方面，本公开内容提供了一种确定受试者具有癌症的可能性的方法，包括：a)从测试受试者收集cfDNA；b)从cfDNA中捕获多于一个靶区组，其中多于一个靶区组包括序列可变靶区组和表观遗传靶区组，从而产生捕获的cfDNA分子组；c)对捕获的cfDNA分子进行测序，其中序列可变靶区组的捕获的cfDNA分子被测序至比表观遗传靶区组的捕获的cfDNA分子更深的测序深度；d)获得由核酸测序仪通过对捕获的cfDNA分子进行测序而产生的多于一个序列读段；e)将多于一个序列读段映射至一个或更多个参考序列以产生映射的序列读段；以及f)处理对应于序列可变靶区组和表观遗传靶区组的映射的序列读段，以确定受试者具有癌症的可能性。
[0017]在一些实施方案中，序列可变靶区组的捕获的cfDNA分子被测序至比表观遗传靶区组的捕获的cfDNA分子深至少2倍的测序深度。在一些实施方案中，序列可变靶区组的捕获的cfDNA分子被测序至比表观遗传靶区组的捕获的cfDNA分子深至少3倍的测序深度。在一些实施方案中，序列可变靶区组的捕获的cfDNA分子被测序至比表观遗传靶区组的捕获的cfDNA分子深4
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10倍的测序深度。在一些实施方案中，序列可变靶区组的捕获的cfDNA分子被测序至比表观遗传靶区组的捕获的cfDNA分子深4
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100倍的测序深度。
[0018]在一些实施方案中，cfDNA扩增包括将包含条形码的衔接子与cfDNA连接的步骤。在一些实施方案中，cfDNA扩增包括将包含条形码的衔接子与cfDNA连接的步骤。
[0019]在一些实施方案中，捕获cfDNA的多于一个靶区组包括使cfDNA与对序列可变靶区组特异性的靶结合探针和对表观遗传靶区组特异性的靶结合探针接触。在一些实施方案中，对序列可变靶区组特异性的靶结合探针以比对表观遗传靶区组特异性的靶结合探针更高的浓度存在。在一些实施方案中，对序列可变靶区组特异性的靶结合探针以比对表观遗
传靶区组特异性的靶结合探针高至少2倍的浓度存在。在一些实施方案中，对序列可变靶区组特异性的靶结合探针以比对表观遗传靶区组特异性的靶结合探针高至少4倍本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离无细胞DNA(cfDNA)的方法，所述方法包括：捕获从测试受试者获得的cfDNA的多于一个靶区组，其中所述多于一个靶区组包括序列可变靶区组和表观遗传靶区组，从而产生捕获的cfDNA分子组；其中在所述捕获的cfDNA分子组中,对应于所述序列可变靶区组的cfDNA分子以比对应于所述表观遗传靶区组的cfDNA分子更高的捕获产量被捕获。2.一种分离无细胞DNA(cfDNA)的方法，所述方法包括：使从测试受试者获得的cfDNA与靶特异性探针组接触，其中所述靶特异性探针组包括对序列可变靶区组特异性的靶结合探针和对表观遗传靶区组特异性的靶结合探针，并且所述靶特异性探针组被配置为以比对应于所述表观遗传靶区组的cfDNA更高的捕获产量捕获对应于所述序列可变靶区组的cfDNA，从而形成靶特异性探针和cfDNA的复合物；并且将所述复合物与未与靶特异性探针结合的cfDNA分开，从而提供捕获的cfDNA分子组。3.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括将所述捕获的cfDNA分子组测序至比对应于所述表观遗传靶区组的cfDNA分子更深的测序深度。4.一种鉴定由肿瘤产生的DNA的存在的方法，所述方法包括：从测试受试者收集cfDNA，从所述cfDNA中捕获多于一个靶区组，其中所述多于一个靶区组包括序列可变靶区组和表观遗传靶区组，从而产生捕获的cfDNA分子组，对所述捕获的cfDNA分子进行测序，其中所述序列可变靶区组的捕获的cfDNA分子被测序至比所述表观遗传靶区组的捕获的cfDNA分子更深的测序深度。5.根据权利要求3
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4中任一项所述的方法，其中所述序列可变靶区组的捕获的cfDNA分子被测序至比所述表观遗传靶区组的捕获的cfDNA分子深至少2倍的测序深度。6.根据权利要求3
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5中任一项所述的方法，其中在测序之前，将所述序列可变靶区组的捕获的cfDNA分子与所述表观遗传靶区组的捕获的cfDNA分子汇集。7.根据权利要求3
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6中任一项所述的方法，其中在同一测序池中对所述序列可变靶区组的捕获的cfDNA分子和所述表观遗传靶区组的捕获的cfDNA分子进行测序。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述cfDNA在捕获之前被扩增，任选地，其中所述cfDNA扩增包括将包含条形码的衔接子与所述cfDNA连接的步骤。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表观遗传靶区组包括超甲基化可变靶区组。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表观遗传靶区组包括低甲基化可变靶区组。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表观遗传靶区组包括片段化可变靶区组。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述片段化可变靶区组包括转录起始位点区。13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述片段化可变靶区组包括CTCF结合区。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中捕获所述cfDNA的多于一个靶区组包
括使所述cfDNA与对所述序列可变靶区组特异性的靶结合探针和对所述表观遗传靶区组特异性的靶结合探针接触。15.根据权利要求14所述的方法，其中对所述序列可变靶区组特异性的靶结合探针以比对所述表观遗传靶区组特异性的靶结合探针更高的浓度存在。16.根据权利要求14所述的方法，其中对所述序列可变靶区组特异性的靶结合探针以比对所述表观遗传靶区组特异性的靶结合探针高至少4倍或5倍的浓度存在。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述表观遗传靶区组的足迹比所述序列可变靶区组的尺寸大至少2倍。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述表观遗传靶区组的足迹比所述序列可变靶区组的尺寸大至少10倍。19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中从所述测试受试者获得的cfDNA基于甲基化水平被分区为至少2个级分，并且对每个级分进行所述方法的随后步骤。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少2个级分包括超甲基化级分和低甲基化级分，并且所述方法还包括将所述超甲基化级分和所述低甲基化级分差异加标签或者对所述超甲基化级分和所述低甲基化级分单独地测序。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述超甲基化级分和所述低甲基化级分被差异加标签，并且所述方法还包括在测序步骤之前汇集差异加标签的超甲基化级分和低甲基化级分。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括确定对应于所述序列可变靶区组的cfDNA分子是否包含癌症相关突变。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括确定对应于所述表观遗传靶区组的cfDNA分子是否包含或指示癌症相关表观遗传修饰或拷贝数变异(例如，聚焦扩增)，任选地，其中所述方法包括确定对应于所述表观遗传靶区组的cfDNA分子是否包含或指示癌症相关表观遗传修饰和拷贝数变异(例如，聚焦扩增)。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症相关表观遗传修饰包括一个或更多个超甲基化可变靶区中的超甲基化。25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述癌症相关表观遗传修饰包括CTCF结合的一个或更多个扰动。26.根据权利要求23
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25中任一项所述的方法，其中所述癌症相关表观遗传修饰包括转录起始位点的一个或更多个扰动。27.一种靶特异性探针的集合，所述靶特异性探针的集合用于捕获由肿瘤细胞产生的cfDNA，所述靶特异性探针的集合包含对序列可变靶区组特异性的靶结合探针和对表观遗传靶区组特异性的靶结合探针，其中对所述序列可变靶区组特异性的靶结合探针的捕获产量比对所述表观遗传靶区组特异性的靶结合探针的捕获产量高至少2倍。28.根据权利要求27所述的靶特异性探针的集合，其中对所述序列可变靶区组特异性的靶结合探针的捕获产量比对所述表观遗传靶区组特异性的靶结合探针的捕获产量高至少4倍或5倍。29.根据权利要求27或28所述的靶特异性探针的集合，其中所述表观遗传靶区组包括超甲基化可变靶区探针组。
30.根据权利要求27
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30中任一项所述的靶特异性探针的集合，其中所述表观遗传靶区组包括低甲基化可变靶区探针组。31.根据权利要求27
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30中任一项所述的靶特异性探针的集合，其中所述表观遗传靶区探针组包括片段化可变靶区探针组。32.根据权利要求31所述的靶特异性探针的集合，其中所述片段化可变靶区探针组包括转录起始位点区探针。33.根据权利要求31或32所述的靶特异性探针的集合，其中所述片段化可变靶区探针组包括CTCF结合区探针。34.根据权利要求27
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33中任一项所述的靶特异性探针的集合，其中在所述序列可变靶区组中存在至少10个区域，并且在所述表观遗传靶区组中存在至少100个区域。35.根据权利要求27
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34中任一项所述的靶特异性探针的集合，其中所述表观遗传靶区组的足迹比所述序列可变靶区组的尺寸大至少2倍。36.根据权利要求35所述的靶特异性探针的集合，其中所述表观遗传靶区组的足迹比所述序列可变靶区组的尺寸大至少10倍。37.根据权利要求27
‑
36中任一项所述的靶特异性探针的集合，其中所述序列可变靶区组的足迹是至少25kB或50kB。38.根据权利要求27
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37中任一项所述的靶特异性探针的集合，其中所述探针存在于单一溶液中。39.一种组合物，所述组合物包含捕获的cfDNA，其中所述捕获的cfDNA包括捕获的序列可变靶区和捕获的表观遗传靶区，并且所述序列可变靶区的浓度大于所述表观遗传靶区的浓度，其中所述浓度针对所述序列可变靶区和所述表观遗传靶区的足迹尺寸进行归一化。40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述捕获的cfDNA包含序列标签。41.根据权利要求39
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40中任一项所述的组合物，其中所述序列可变靶区的浓度比所述表观遗传靶区的浓度大至少4倍或5倍。42.根据权利要求39
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【专利技术属性】
技术研发人员：安德鲁，
申请(专利权)人：夸登特健康公司，
类型：发明
国别省市：