一种少量细胞的透射电镜样品制备方法技术

本发明专利技术提供一种少量细胞的透射电镜样品制备方法，涉及透射电镜技术领域，包含以下步骤：将细胞加入到EP管中，将收集的细胞加入预冷的戊二醛固定液中，EP管离心，取出上清液，加入1%琼脂糖凝胶，挑起细胞团块包裹在琼脂糖凝胶中，冷却至固定状态后，切割重新加入戊二醛固定液，使用二甲坤酸钠缓冲液清洗，乙醇逐级脱水；细胞浸透；将细胞样品逐步加温聚合，形成包埋块；对包埋块中细胞密集块区域打磨并切割成树脂小块；切成半薄切片，染色定位，打磨只剩目标区域后以目标区域以中心用钻石刀切超薄切片，得到透射电镜样品。上述制备方法，减少了离心的次数，从而避免了细胞形貌发生改变，能够真实反映细胞内部物质真实的形貌。够真实反映细胞内部物质真实的形貌。够真实反映细胞内部物质真实的形貌。

【技术实现步骤摘要】
一种少量细胞的透射电镜样品制备方法


[0001]本专利技术涉及透射电镜
，尤其涉及一种少量细胞的透射电镜样品制备方法。
[0002]
技术介绍

[0003]透射电镜(Transmission Electron Microscopy，TEM)是IC行业观测微观结构非常重要的工具和手段。在线检测的很多关键尺寸都需要和透射电镜的测量值做比较，同时也是解决在线检测很多问题的一个重要方式。
[0004]常规的透射电镜包埋方法对细胞样品的数量要求较高，基本采取离心取沉淀物进行样品处理与包埋的方法。而离心次数过多会造成样品有形物质形貌发生改变，操作步骤比较繁琐，比较消耗时间。当细胞样品数量不足够多的话，多次离心和后续的操作会造成细胞不同程度的丢失，很难进行包埋，包埋后对后期进行超薄切片和电镜观察造成诸多不便。
[0005]
技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了解决现有技术中细胞需要量太多，且容易丢失的缺陷。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种少量细胞的透射电镜样品制备方法，包含以下步骤：S1：准备细胞，将细胞加入到EP管中，S2：标本固定：将S1中收集的细胞加入预冷的戊二醛固定液中，使用EP管离心，取出上清液，加入1%琼脂糖凝胶，挑起EP管底部的细胞团块包裹在琼脂糖凝胶中，冷却至固定状态后，切割并重新加入戊二醛固定液，再使用二甲坤酸钠缓冲液清洗多次，然后使用纯水清洗；S3：使用乙醇逐级脱水；S4：使用环氧丙烷、环氧丙烷及纯Epon
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812溶液的混合液及Epon
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812环氧树脂分别对细胞浸透；S5：将S4中的细胞样品逐步加温聚合，形成包埋块；S6：对S5中的包埋块进行观察，对细胞密集块区域进行打磨并切割成树脂小块；S7：对树脂小块进行切片形成半薄切片，并对细胞区域进行染色定位，然后根据半薄切片图像提示选取目标区域，对半薄切片进行修块及打磨，只剩目标区域后以目标区域以中心用钻石刀切厚度为70
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90nm的超薄切片，得到目标区域细胞断面，即为透射电镜样品。
[0008]优选的，所述S1具体包含以下步骤：将培养在培养皿或者培养瓶中的细胞使用PBS清洗，并将清洗后的细胞加入到1.5ml的EP管中，并经过离心后，细胞聚集在管底。
[0009]优选的，所述S2中将S1中的细胞加入预冷的戊二醛固定液1ml，加入过程中稳定EP
管，并在加入完成后，在4℃条件下固定2h或者过夜。
[0010]优选的，所述S2中琼脂糖凝胶提前配置，并在加入前进行加热然后自然冷却至40
‑
50℃，琼脂糖凝胶加入量为100 ul，自然冷却至琼脂糖凝胶至固定状态后，切割呈1：1：1的小方块。
[0011]优选的，所述S2中使用的二甲坤酸钠缓冲液清洗6次，每次15min，然后使用1%锇酸固定2h，再使用纯水清洗6次每次5min，在4℃条件下进行。
[0012]优选的，乙醇逐级脱水使用浓度为30%、50%、70%、80%、90%的乙醇分别脱水一次，然后使用无水乙醇脱水两次。
[0013]优选的，所述S4具体包含以下步骤：B1：使用环氧丙烷置换两次；B2：使用环氧丙烷和纯Epon
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812按2：1的比例混合溶液对细胞浸透；B3：使用环氧丙烷和纯Epon
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812按1：2的比例混合溶液对细胞浸透；B4：使用Epon
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812环氧树脂对细胞浸透，浸透温度37℃ ，浸透时间7h，得到细胞样品。
[0014]优选的，所述S5中的逐步加温聚合顺序为：首先放入37℃烘箱24h；然后放入45℃烘箱24h；再放入60℃烘箱24h；最后放入37℃烘箱。
[0015]优选的，所述S7中使用醋酸铀
‑
柠檬酸铅对细胞区域进行双重染色，并在染色完成后使用纯水冲洗，并使用红外灯照射烘干。
[0016]优选的，所述醋酸铀为醋酸双氧铀，使用25%饱和醋酸铀，用50
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70%乙醇配制得到，所述柠檬酸铅的配方为硝酸铅1.33克，柠檬酸纳1.76克，蒸馏水30毫升；震荡半小时，加入1N 氢氧化钠5毫升，加蒸馏水配制50毫升。
[0017]上述所述的一种少量细胞的透射电镜样品制备方法，可以避免多次离心影响细胞形貌发生改变，能够真实反映细胞内部物质真实的形貌，且对细胞样品的数量没有太多的要求，在实际操作中，可以应用于各种细胞样品或者类似于细胞等体积过小，容易松散样品的透射电镜观察。
[0018]附图说明
[0019]图1为利用本专利技术方法得到的透射电镜细胞样品Epon
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812环氧树脂包埋块示意图；图2为利用常规方法得到的透射电镜细胞样品Epon
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812环氧树脂包埋块示意图。
[0020]具体实施方式
[0021]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步地详细说明。
[0022]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是，本专利技术还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本专利技术并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
[0023]一种少量细胞的透射电镜样品制备方法，包含以下步骤：S1：细胞准备：具体的，将培养在培养皿或者培养瓶中的细胞使用PBS漂洗，在一实施方式中，所述PBS的pH值为7.2，漂洗次数为3次，每次漂洗时间为0.5min；然后将清洗后的细胞加入到1.5ml的EP管中，在一实施方式中，使用胰酶消化法将细胞加入到1.5ml的EP管中，在一实施方式中，胰酶消化法使用的胰酶浓度为2.5%，消化时间根据细胞状态来确定。经过离心后，细胞聚集在管底，在一实施方式中，离心转速为1500r/min，离心5min。在其他实施方式中，可以根据实验要求使用刮片法或者其他方法将细胞加入到1.5ml的EP管中。
[0024]S2：标本固定：A1：标本的初始固定：将S1中收集好的细胞加入到预冷的戊二醛固定液1ml，加入过程中稳定1.5ml的EP管，以免造成细胞分散后不成团块，加入完成后，在4℃条件下固定2h或者过夜。
[0025]A2：琼脂糖凝胶包裹：提前配置好1%琼脂糖凝胶，加入微波炉中进行加热，然后自然冷却至40
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50℃，在一实施方式中，使用的琼脂糖凝胶为浓度1%不含EB的琼脂糖。
[0026]对A1中的EP管进行离心，弃去上清液，加入100 ul的琼脂糖凝胶，然后挑起EP管底部的细胞团块包裹在琼脂凝胶糖中，挑起过程中需要动作轻柔，防止细胞团块损坏，自然冷却至琼脂糖凝胶至固定状态，进行切割呈1：1：1的小方块，且在不破坏凝胶包裹细胞的前提下尽可能的切小，然后重新加入4%戊二醛固定液1ml，在4℃下放置。
[0027]A3：标本后固定：使用0.1mol/L的二甲坤酸钠缓冲液清洗6次，每次15min，然后使用1%锇酸固定2h，再使用纯水清洗6次每次5min，在4℃本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种少量细胞的透射电镜样品制备方法，其特征在于：包含以下步骤：S1：准备细胞，将细胞加入到EP管中，S2：标本固定：将S1中收集的细胞加入预冷的戊二醛固定液中，使用EP管离心，取出上清液，加入1%琼脂糖凝胶，挑起EP管底部的细胞团块包裹在琼脂糖凝胶中，冷却至固定状态后，切割并重新加入戊二醛固定液，再使用二甲坤酸钠缓冲液清洗多次，然后使用纯水清洗；S3：使用乙醇逐级脱水；S4：使用环氧丙烷、环氧丙烷及纯Epon
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812溶液的混合液及Epon
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812环氧树脂分别对细胞浸透；S5：将S4中的细胞样品逐步加温聚合，形成包埋块；S6：对S5中的包埋块进行观察，对细胞密集块区域进行打磨并切割成树脂小块；S7：对树脂小块进行切片形成半薄切片，并对细胞区域进行染色定位，然后根据半薄切片图像提示选取目标区域，对半薄切片进行修块及打磨，只剩目标区域后以目标区域以中心用钻石刀切厚度为70
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90nm的超薄切片，得到目标区域细胞断面，即为透射电镜样品。2.根据权利要求1所述的少量细胞的透射电镜样品制备方法，其特征在于：所述S1具体包含以下步骤：将培养在培养皿或者培养瓶中的细胞使用PBS清洗，并将清洗后的细胞加入到1.5ml的EP管中，并经过离心后，细胞聚集在管底。3.根据权利要求1所述的少量细胞的透射电镜样品制备方法，其特征在于：所述S2中将S1中的细胞加入预冷的戊二醛固定液1ml，加入过程中稳定EP管，并在加入完成后，在4℃条件下固定2h或者过夜。4.根据权利要求1所述的少量细胞的透射电镜样品制备方法，其特征在于：所述S2中琼脂糖凝胶提前配置，并在加入前进行加热然后自然冷却至40
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50℃，琼脂糖凝胶加入量为100 ul，自然冷却至琼脂糖凝胶至固定状态后，切割...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘芳，李贵才，徐佳炜，王莹洁，朱昌来，张天一，杨宇民，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：