一种负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法及应用。所述负载bFGF的肝素化DAT是由新鲜来源的脂肪在

【技术实现步骤摘要】
一种负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及脂肪组织工程生物材料领域，具体涉及一种负载碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的肝素化脱细胞脂肪(DAT)的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]无免疫原性的脱细胞组织越来越多地用于组织工程中，相较于其他组织，体表脂肪的易获取、来源广的优势受到了学界的独特青睐，再加上脱细胞脂肪组织天然的成脂诱导能力，致使脱细胞脂肪在脂肪组织工程中具有强大的应用前景。
[0003]尽管脱细胞脂肪(Decellularized adipose tissue,DAT)移植后可促进局部组织的再血管化和脂肪新生，但其血管化及成脂效果还难以满足临床需求，再加上现有的脱细胞脂肪无法满足标准化生产和规模化生产的要求，并不能满足病患即需即取的要求。因此，寻求和开发一种具有更强成脂特性和血管化能力的DAT是组织工程研究学界的共同追求。
[0004]技术方案
[0005]本专利技术的目的是提供一种可以即需即取，易于保存的负载碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的肝素化脱细胞脂肪(DAT)的制备方法和应用，该生物材料来源于动物(含人体)体表分布广泛的脂肪组织，无免疫原性且具有良好的成脂特性，满足标准化生产和规模化生产的要求，能够预先制备和保存，使患者能够即需即取，具有广阔的临床应用前景。
[0006]为了达到上述技术目的，本专利技术提供了一种负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法，所述制备方法的具体步骤如下：
[0007](1)脱细胞脂肪(DAT)的制备：
[0008]a.取新鲜来源的脂肪在
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80℃至37℃的条件环境下冷冻复融3～5次，每次1～2h，然后取冻融后的脂肪剪碎或采用均质、离心处理后保留脂肪层；
[0009]b.将步骤a中至直接剪碎的脂肪或收集的脂肪层置于Trypsin
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EDTA(胰蛋白酶
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EDTA消化液)中振荡消化16h～24h后，然后用PBS缓冲液洗涤3～5次，每次30～60min，然后置于异丙醇中振荡浸泡处理48h～72h，每24h换液一次，并用PBS缓冲液洗涤后再次用体积浓度为1％～3％的Triton X
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100(聚乙二醇辛基苯基醚)去污剂振荡消化1h～2h，PBS缓冲液洗涤3～5次后，再次在Trypsin
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EDTA消化液中振荡消化4h～6h。
[0010]c.将步骤b中振荡消化后的脂肪采用PBS缓冲液洗涤，并使用核酸酶(Benzonase)浓度大于≥100U/mL的PBS溶液振荡处理16h～24h，再次使用异丙醇振荡浸泡处理8h～12h后，采用PBS缓冲液洗涤，最后使用乙醇消毒液浸泡3～5次得到灭菌后的脱细胞脂肪，每次浸泡时间为30min～60min；
[0011](2)肝素化脱细胞脂肪的制备：
[0012]a.在浓度为0.1mol/L的MES缓冲液中加入EDC(1
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(3
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二甲氨基丙基)
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乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N
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羟基琥珀酰亚胺)和肝素钠配制成MES缓冲液混合溶液，并在室温下反应孵育15min～30min；其MES缓冲液混合溶液中，EDC(1
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(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N
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羟基琥珀酰亚胺)的摩尔浓度比为3:5，肝素钠的质量分数为0.5％～
1.5％；
[0013]b.取步骤(1)中制备的脱细胞脂肪按照质量百分比1％～2％加入步骤a中反应后的MES缓冲液混合溶液中，并在温度为25℃～37℃、振荡频率为60rpm～120rpm的条件下振荡反应16h～24h得到肝素化脱细胞脂肪；将反应后得到肝素化脱细胞脂肪使用Na2HPO4溶液洗涤30min～60min后，再使用NaCl溶液洗涤3～5次，每次30min～60min，最后用无菌PBS缓冲液洗涤3～5次，每次10min～30min，最后得到肝素化脱细胞脂肪，并将其保存于无菌离心管中；
[0014](3)负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪的制备：取步骤(2)中制备的肝素化脱细胞脂肪切碎直至形成均匀的凝胶状匀浆，按照每mL无菌bFGF溶液加入2000mg肝素化脱细胞脂肪的比例浸泡于浓度为1μg/mL～5μg/mL的无菌bFGF溶液中，并在4℃条件下孵育16h～24h；然后，取出反应后的肝素化脱细胞脂肪，并用无菌PBS溶液清洗3～5次，每次3～5min，洗脱未交联的bFGF后即得到负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪材料，并将其置于4℃无菌保存。
[0015]本专利技术进一步的技术方案：所述步骤(1)的a步骤中所述的新鲜脂肪为鼠来源、兔来源、人来源或其他动物来源；将新鲜脂肪冻融后直接切碎成0.5x0.5cm的小块；或者将新鲜脂肪冻融后加入等体积的去离子水，采用均质器在转速12000～15000rpm的转速下均质5～10min；并将均质处理后的组织悬浮液在离心转速为1500～3000rpm的条件下离心5～10min，去除最上层黄色油脂及最下层水分，保留中间的脂肪层。
[0016]本专利技术较优的技术方案：所述步骤(1)的b步骤中的Trypsin
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EDTA消化液的质量浓度为0.05％～0.25％。
[0017]本专利技术较优的技术方案：所述步骤(1)的c步骤中的消毒液采用体积浓度75％的乙醇或含有过氧乙酸的乙醇水溶液，其中，含有过氧乙酸的乙醇水溶液中过氧乙酸的体积百分比为0.1％，乙醇的体积百分比为4％。
[0018]本专利技术较优的技术方案：所述步骤(1)中的异丙醇的质量浓度为99.9％；所述步骤(1)中的去离子水和PBS缓冲液中均按照质量体积比加入100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B；所述步骤(1)得到的脱细胞脂肪储存在无菌PBS缓冲液中。
[0019]本专利技术较优的技术方案：所述步骤(2)的b步骤中Na2HPO4溶液的浓度为0.1～0.2mol/L，所述NaCl溶液的摩尔浓度为1～4mol/L。
[0020]本专利技术较优的技术方案：所述步骤(2)的含EDC/NHS的MES缓冲液、Na2HPO4溶液、NaCl溶液在配置后均用0.22μm除菌过滤器过滤后并保存于无菌容器中。
[0021]本专利技术还提供的了一种上述任意一项中的方法制备的负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪材料的的应用，其特征在于：将所述负载bFGF的脱细胞脂肪材料作为脂肪填充物用于脂肪组织的再生或重建。
[0022]本专利技术进一步的技术方案：将所述负载bFGF的脱细胞脂肪材料在24h内注射至由高分子聚合物制备的3D打印支架中，并连同3D打印支架一起作为脂肪填充物用于脂肪组织的再生或重建。
[0023]本专利技术较优的技术方案：所述3D打印支架材料包括聚己内酯、聚乳酸、聚
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β
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪材料的制备方法其特征在于具体步骤如下：(1)脱细胞脂肪的制备：a.取新鲜来源的脂肪在
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80℃至37℃的条件环境下冷冻复融3～5次，每次1～2h，然后取冻融后的脂肪剪碎或采用均质、离心处理后保留脂肪层；b.将步骤a中至直接剪碎的脂肪或收集的脂肪层置于Trypsin
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EDTA消化液中振荡消化16h～24h后，然后用PBS缓冲液洗涤3～5次，每次30～60min，然后置于异丙醇中振荡浸泡处理48h～72h，每24h换液一次，并用PBS缓冲液洗涤后再次用体积浓度为1％～3％的Triton X
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100去污剂振荡消化1h～2h，PBS缓冲液洗涤3～5次后，再次在Trypsin
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EDTA消化液中振荡消化4h～6h。c.将步骤b中振荡消化后的脂肪采用PBS缓冲液洗涤，并使用Benzonase浓度大于≥100U/mL的PBS溶液振荡处理16h～24h，再次使用异丙醇振荡浸泡处理8h～12h后，采用PBS缓冲液洗涤，最后使用乙醇消毒液浸泡3～5次得到灭菌后的脱细胞脂肪，每次浸泡时间为30min～60min；(2)肝素化脱细胞脂肪的制备：a.在浓度为0.1mol/L的MES缓冲液中加入1
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二甲氨基丙基)
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乙基碳二亚胺盐酸盐、N
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羟基琥珀酰亚胺和肝素钠配制成MES缓冲液混合溶液，并在室温下反应孵育15min～30min；其MES缓冲液混合溶液中，1
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(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和N
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羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度比为3:5，肝素钠的质量分数为0.5％～1.5％；b.取步骤(1)中制备的脱细胞脂肪按照质量百分比1％～2％加入步骤a中反应后的MES缓冲液混合溶液中，并在温度为25℃～37℃、振荡频率为60rpm～120rpm的条件下振荡反应16h～24h得到肝素化脱细胞脂肪；将反应后得到肝素化脱细胞脂肪使用Na2HPO4溶液洗涤30min～60min后，再使用NaCl溶液洗涤3～5次，每次30min～60min，最后用无菌PBS缓冲液洗涤3～5次，每次10min～30min，并将洗涤后的肝素化脱细胞脂肪保存于无菌离心管中；(3)负载bFGF的肝素化脱细胞脂肪的制备：取步骤(2)中制备的肝素化脱细胞脂肪切碎直至形成均匀的凝胶状匀浆，按照每mL无菌bFGF溶液加入2000mg肝素化脱细胞脂肪的比例浸泡于浓度为1μg/mL～5μg/mL的无菌bFGF溶液中，并在4℃条件下孵育16h～24h；然后，取出反应后的肝素化脱细胞脂肪，并用无菌PBS溶液清洗3～5次，每次3～5...

【专利技术属性】
技术研发人员：张郭，汪振星，孙家明，慈海，周牧冉，陈佳龙，刘绍恺，陈雳风，赵阳，罗超，曾宇阳，方慧敏，侯金飞，谢昕芳，孙谛，刘剑，王冰倩，倪若飘，王斌，李志鹏，姜文彬，揭君津，周莹芊，郭亚琪，锁丽涛，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：