固相肽合成方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术涉及进行固相肽合成的方法、自动并行的固相肽合成以及设计用于实施这种方法的装置。根据本发明专利技术，在进行固相肽合成的反应介质上的所述方法期间，频率超过25kHz的超声至少间歇地作用。少间歇地作用。少间歇地作用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】固相肽合成方法及装置


[0001]本专利技术涉及进行固相肽合成的方法、自动并行的固相肽合成以及适于实施这种方法的装置。

技术介绍

[0002]固相肽合成(SPPS或也称为Merrifield合成)是由诺贝尔奖获得者Robert Bruce Merrifield于1962年引入的一种肽合成方法，其中使用了不溶性聚合物载体。线性肽是通过逐步连接序列特异性的、临时保护的氨基酸来构建的，其中生长的多肽链的C端与合成树脂载体共价连接。为确保受控反应并避免副反应，氨基酸的反应性功能侧链必须由合适的保护基团封闭。虽然要连接的氨基酸的α
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氨基只需要在实际的偶联反应期间受到保护，但永久性侧链保护基团仅在合成完成后才从肽中切割。与核糖体蛋白质生物合成相反，肽链的延伸从C端发生到N端。聚苯乙烯和1
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2％的1,4
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二乙烯基苯的共聚物已被证明是合适的聚合物载体。通过珠粒聚合获得的直径在20到100微米之间的树脂珠粒在用于合成的溶剂中溶胀，从而变得可渗透进试剂。叔丁氧羰基(Boc)和芴基
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甲氧羰基(Fmoc)基团主要用作中间体α
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氨基保护基团。Boc基团在催化氢化和碱水解方面是稳定的，并且可以通过温和的酸解(例如用50％三氟乙酸(TFA))分解。在各个偶联步骤后不断重复酸的解封闭反应会导致侧链保护基团的部分解封闭以及锚键与聚合物载体的轻微水解。Fmoc基团的优点是它可以通过用合适的碱(例如吗啉、2
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氨基乙醇或哌啶)处理进行切割。如果将酸不稳定、耐碱基团用作聚合物载体上的锚定基团，并且为了保护相应氨基酸结构单元的第三功能，中间保护基团和永久保护基团可以有利地彼此独立地分开。
[0003]偶联反应(也称为缩合或肽增殖(peptide propagation)是合成中极其重要的步骤，因为完全转化是最终产品均匀性的基本要求。通常，试剂过量使用，优选酸酐、活性酯或所谓的原位活化剂，其中形成中间活化的酯衍生物。不断重复分解α
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氨基保护基团和连接下一个Nα
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保护氨基酸的反应步骤(偶联反应、缩合)使合成步骤和肽合成器的构建实现了广泛的自动化，其中大部分工作根据流通原理进行。树脂被放置在底部带有玻璃料的柱子中，以便试剂和溶剂可以自动加入，与载体材料混合，然后被提取出来。重复这些步骤直到达到要构建的肽的所需长度。最后，合成的肽与聚合物载体分离。从树脂基质上分离是通过试剂实现的，根据选择的保护基方案，选择性地切割C端氨基酸和载体之间的锚键，或同步引起合成肽的部分或完全解封。多种肽合成法是从固相肽合成发展而来的。[E.Atherton and R.C.Sheppard Solid
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Phase Synthesis
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A Practical Approach,Oxford University Press,1989；H.
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D.Jakubke Peptides:Chemistry and Biology,published by Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg,1996][0004]自动化肽合成的一个主要挑战是避免交叉污染，因为在已知程序和自动化装置中，试剂通过相同的管道系统和套管。为了防止交叉污染，在已知的设备布置中，整个系统用大量冲洗剂冲洗。
[0005]DE 101 31 088 B4开创并提供了一种能够自动、同时、多重和并行合成的设备，其
中可以排除交叉污染。这使得合成时间的显著减少。
[0006]在肽合成中缩短合成时间的另一种方法是在合成过程中将试剂暴露在微波辐射下。这使得可以将合成时间减少到十分之一。然而，微波辅助反应必须在特殊的保护空间中进行。因此，该方法仅限于较小的反应器，因此生产量较低。此外，已发现并非所有常用的保护基团对微波辐射都是稳定的，因此可能会出现收率降低和更多杂质。
[0007]1977年，CA 101 93 24发表了通过超声波辅助合成的尝试。然而，在接下来的几年中，很明显，这种方法，至少在所示出的形式中，并没有产生预期的结果。用通常的方法无法观察到合成时间的可再现加速。
[0008]现在本专利技术的目的是进一步加快固相肽合成的合成时间，同时保持或提高收率和纯度。该方法特别适用于自动化的并行方法。

技术实现思路

[0009]该目的通过一种用于进行自动平行固相肽合成的方法以及一种用于进行具有独立权利要求特征的所述方法的装置来实现。
[0010]因此，本专利技术的第一方面涉及进行固相肽合成(下文也称为合成或肽合成)的方法。根据本专利技术的方法包括如下步骤：
[0011]a)将在N端被保护基团保护的氨基酸通过氨基酸的C端结合到固体载体材料上，
[0012]b)切割保护基团，
[0013]c)进行至少一种肽增殖，以及
[0014]d)通过从载体材料上切割肽来终止反应，
[0015]其中步骤a)至d)发生在液体反应介质中，并且至少在各步骤中的一个期间，具有>25至2000kHz范围内的频率的超声至少间歇地作用于反应介质。
[0016]已经发现，超声波仅从超过40kHz频率对固相肽合成中所讨论的反应有加速作用。因此，根据本专利技术的方法能够可再现地减少固相肽合成的合成时间，从而使其至少在微波辅助肽合成中的合成时间范围内。然而，有利地，不必采取特殊的安全预防措施。此外，所需设备的采购和维护成本较低。这意味着该方法几乎可用于任何合成设备，尤其是并行和/或自动化合成设备。
[0017]步骤a)在本文被理解为是指将官能团直接或间接结合到合适的载体材料，例如用于固相肽合成的预加载或非预加载树脂或酰胺树脂。该官能团可以特别地通过Fmoc保护基团来保护。这里，预加载或未预加载是指至少一个第一和任选至少一个随后的氨基酸，即待合成的氨基酸序列中的一级氨基酸，已经直接结合到载体材料上的事实。
[0018]超过40kHz、优选超过50kHz、尤其超过75kHz、特别优选超过100kHz的频率已被证明是特别合适的，因为可以用更高的频率实现更显著的合成时间减少。已经发现，空化的形成对于肽合成有显著的积极影响，尤其是质量的提高。相关的空化从40kHz的频率开始，并随着频率的增加而增强。在20到40kHz的频率范围内，只发生振动激发。
[0019]优选地，根据本专利技术的方法的超声频率不超过2MHz，特别是1MHz。优选频率的进一步解释如下。
[0020]本文描述的超声辅助固相肽合成(USPS)属于化学合成中的声化学范畴。
[0021]超声波的化学效应不能是声场的直接效应，因为通常的频率太低，低了几个数量
级，即使是简单的旋转运动也无法激发。
[0022]我们假定所述积极效果与由超声波触发的空化和由此产生的压力脉冲直接相关。空化发生在40kHz至2MHz的频率范围内。
[0023]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于实施固相肽合成的方法，包括步骤：a)将在N端被保护基团保护的氨基酸通过氨基酸的C端结合到固体载体材料上，b)切割保护基团，c)进行至少一种肽增殖，以及d)通过从载体材料上切割肽来终止反应，其中步骤a)至d)发生在液体反应介质中，并且至少在各步骤中的一个期间，频率在25至2000kHz范围内的超声至少间歇地作用于反应介质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，超声波以大于40kHz、特别是大于75kHz、优选大于100kHz、特别优选大于110kHz范围内的频率作用于反应介质。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述超声波以不超过1000kHz、优选不超过500kHz范围内的频率作用于反应介质。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述超声波经由外部液体浴被传输至反应介质。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括步骤b)之后发生的洗涤步骤W
b
)，步骤c)之后发生的洗涤步骤W
c
)和/或步骤d)之后发生的洗涤步骤W
d
)，其中在这些步骤中的至少一个期间超声也作用于反应介质。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述氨基酸在N端被碱不稳定保护基团保护，特别是可以通过仲胺切割的保护基团，特别是芴甲氧羰基(Fmoc)。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述氨基酸包含用于保护侧链的保护基团，特别是S
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2,4,6
‑
三甲氧基苄基(Tmob)、三苯甲基(Trt)、叔丁基(tBu)、叔丁氧羰基(Boc)、2,2,4,6,7
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五甲基二氢苯并呋喃
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磺酰基(Pbf)。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，超声波仅在一个步骤中，特别是在步骤c)中，作用于反应介质。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在所有步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：奥利弗，
申请(专利权)人：奥利弗，
类型：发明
国别省市：