一种具有抑制人结肠癌细胞(HT-29细胞)增殖作用的鸡源胶原肽及其制备与应用制造技术

技术编号:30770123 阅读:9 留言:0更新日期:2021-11-10 12:38
一种具有抑制人结肠癌细胞(HT

【技术实现步骤摘要】
一种具有抑制人结肠癌细胞(HT

29细胞)增殖作用的鸡源胶原肽及其制备与应用


[0001]本专利技术涉及蛋白领域,具体涉及一种具有抑制人结肠癌细胞(HT

29细胞)增殖作用的鸡III型胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR及其应用。

技术介绍

[0002]结肠癌是全世界发病率和病死率较高的恶性肿瘤之一, 在世界范围内年发病率较高,仅次于肺癌及胃癌,严重威胁人类的健康。结肠癌发病的主要原因是高脂肪饮食和纤维素摄入不足。近年来, 随着人们的生活质量与水平逐渐提高,人们的生活习惯与饮食结构发生了很大的变化。我国结肠癌的发病率呈逐年上升的趋势,如何有效控制及治疗结肠癌是一个比较热门的课题。
[0003]生物活性肽一类天然的多肽类物质。其活性随着氨基酸组成的不同以及氨基酸排列顺序不同而发生改变,因此具有抗氧化、抗菌、抗癌、降血压和提高人体免疫力等生理活性。生物活性肽具有易消化、吸收的营养特点,在医药、保健品、食品基料等方面具有很大的发展潜力,已成为当前国际抗癌药物及具有抗癌活性的产品。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供鸡III型胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR具有抑制HT

29细胞增殖作用(p为羟脯氨酸),作为预防和治疗结肠炎或结肠癌有关的疾病的食品、保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。
[0005]为实现上述目的,本专利技术一所述胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR为抑制HT

29细胞增殖作用的有效成份。
[0006]胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR来自鸡III型胶原。胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR为预防和治疗结肠炎或结肠癌有关的疾病的食品、保健品和药物先导化合物的活性成份,其中可添加食品学或药物学上可接受的载体或辅料。
[0007]具有抑制HT

29细胞增殖作用的胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR的氨基酸序列为Gly

Ser

Hyp

Gly

Pro

Hyp

Gly

Pro

Ser

Gly

Pro

Ala

Gly

Asp

Arg。单链线性结构,分子量为1337.30,白色粉末状,易溶于水,对HT

29细胞增殖有抑制作用。
[0008]与现有技术相比,本专利技术具有如下优点:本专利技术从鸡源III型胶原中获得并确定了胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR的活性与功效,其具有抑制HT

29细胞增殖作用,易于被人体吸收,并且具有补充人体必须氨基酸的能力及营养功能,作为预防和治疗结肠炎或结肠癌有关的疾病的食品、保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。
附图说明
[0009]图1为胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR的一级质谱图;
图2为胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR的二级质谱图;图3为胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR抑制HT

29细胞增殖的实验结果。
具体实施方式
[0010]下面结合实施例用于说明本专利技术作进一步详细的描述,但不用来限制本专利技术的范围。
[0011]实施例1 胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR的合成本专利技术利用多肽合成仪采用固相合成法合成胶原肽:称取0.05mmol Fmoc

Ala

Wang树脂(官能团含量0.33mmol/g)置于固相反应器中,加8mL DCM溶胀过夜,减压抽去溶剂。加入浓度为 200mL/L的哌啶溶液8mL,室温下反应5min,抽干 ;再加入浓度为200mL/L的哌啶溶液8mL,室温下反应20min,抽干;依次用8mL的DMF洗涤3次,每次lmin。准确量取0.2mmol的α

氨基被Fmoc保护的氨基酸溶液、0.2mmol的HBTU溶液、0.195mmol的HOBT 溶液加入固相反应器中,反应5min后加入0.4mmol的DIEA,室温下氮气气泡振荡反应2h。依次用8mL的DMF洗涤3次,每次1min。加入浓度为200mL/L的哌啶溶液8mL,室温下反应5min,抽干;再加入浓度为200mL/L的哌啶溶液8mL,室温下反应20min,抽干;依次以8mL的 DMF洗涤3次,每次1min。按照如上步骤从肽链的碳端到氮端逐一连续合成了胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR。待合成完毕后,分别用DMF和DCM先后清洗连有多肽链的树脂,后将树脂至于真空干燥箱内干燥备用。
[0012]待树脂干燥后,将树脂转移至鸡心瓶中,加入磁子,在冰水浴下缓慢加入用于脱除树脂的切割液10mL(切割液中TFA :纯水:苯甲硫醚:苯酚:乙二硫醇比例为82.5:5:5:5:2.5),冰水浴下反应2h。待反应完成,将反应液连同树脂一同转移至过滤器中,用水泵抽滤,将得到的滤液置于圆底烧瓶中,并在氮气流下吹干。待圆底烧瓶中的样品吹至粘稠,撤下氮气管,在圆底烧瓶中倒入约20mL的4℃冰乙醚,混合后充分打散,然后于冷冻离心机内,4℃下 8000r/min离心15min,弃上清,再于20mL的4℃冰乙醚中打散,离心;如此重复操作3次,将沉淀再次真空干燥,即得胶原肽。
[0013]用反向高效液相色谱法对胶原肽进行纯化鉴定。采用C18半制备柱,流动相:A相(水相) :去离子水(含0.1% TFA(m/v)) ;B相(有机相):80%乙腈水溶液(含0.1%TFA(m/v)) ;流速:6mL/min ;洗脱梯度:A相以每分钟1%的变化从55%降到10%,B相以每分钟1%的变化从45%升到90%。采集6

8min 的洗脱液,采用旋转蒸发仪除去洗脱液中的有机相乙腈,之后将剩余的肽水溶液放入冰箱冷冻,最后用冷冻干燥机除去水分,得到蓬松固体粉末,为胶原肽纯品。图1为其一级质谱图,一级质谱中的信号为胶原肽母离子肽段信号。图2为胶原肽的二级质谱,该质谱图中包含了胶原肽的各种碎片离子信息的质荷比及丰度。
[0014]实施例2 胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR抑制HT

29细胞增殖活性检测将HT

29细胞接种于平底96孔细胞培养板,每孔100μL,含5
×
104个细胞,使细胞贴壁,孵育培养24h后,用DMEM完全培养液稀释胶原肽,然后将稀释的药物加入96孔细胞培养板,胶原肽浓度设三个复孔,对照孔只加100μL细胞培养液。由于加药后,各孔总体积为100μL,胶原肽浓度为600 μg/mL。加药后,细胞继续培养24小时。
[0015]如无特殊说明,本专利技术所制备的胶原肽处理细胞24小时后,采用CCK

8法检测细胞
生长情况。细胞培养完成后,吸出孔中本文档来自技高网
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胶原肽,其特征在于:所述多肽为GSpGPpGPSGPAGDR;该多肽的氨基酸序列为Gly

Ser

Hyp

Gly

Pro

Hyp

Gly

Pro

Ser

Gly

Pro

Ala

Gly<...

【专利技术属性】
技术研发人员:黄雅钦邓贵雅郭尚伟
申请(专利权)人:北京化工大学
类型:发明
国别省市:

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