一种具有抑制人结肠癌细胞（HT-29细胞）增殖作用的鸡源胶原肽及其制备与应用制造技术

一种具有抑制人结肠癌细胞（HT

【技术实现步骤摘要】
一种具有抑制人结肠癌细胞（HT
‑
29细胞）增殖作用的鸡源胶原肽及其制备与应用


[0001]本专利技术涉及蛋白领域，具体涉及一种具有抑制人结肠癌细胞（HT
‑
29细胞）增殖作用的鸡III型胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR及其应用。

技术介绍

[0002]结肠癌是全世界发病率和病死率较高的恶性肿瘤之一, 在世界范围内年发病率较高,仅次于肺癌及胃癌，严重威胁人类的健康。结肠癌发病的主要原因是高脂肪饮食和纤维素摄入不足。近年来, 随着人们的生活质量与水平逐渐提高,人们的生活习惯与饮食结构发生了很大的变化。我国结肠癌的发病率呈逐年上升的趋势,如何有效控制及治疗结肠癌是一个比较热门的课题。
[0003]生物活性肽一类天然的多肽类物质。其活性随着氨基酸组成的不同以及氨基酸排列顺序不同而发生改变，因此具有抗氧化、抗菌、抗癌、降血压和提高人体免疫力等生理活性。生物活性肽具有易消化、吸收的营养特点，在医药、保健品、食品基料等方面具有很大的发展潜力，已成为当前国际抗癌药物及具有抗癌活性的产品。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供鸡III型胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR具有抑制HT
‑
29细胞增殖作用（p为羟脯氨酸），作为预防和治疗结肠炎或结肠癌有关的疾病的食品、保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。
[0005]为实现上述目的，本专利技术一所述胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR为抑制HT
‑
29细胞增殖作用的有效成份。
[0006]胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR来自鸡III型胶原。胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR为预防和治疗结肠炎或结肠癌有关的疾病的食品、保健品和药物先导化合物的活性成份，其中可添加食品学或药物学上可接受的载体或辅料。
[0007]具有抑制HT
‑
29细胞增殖作用的胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR的氨基酸序列为Gly
‑
Ser
‑
Hyp
‑
Gly
‑
Pro
‑
Hyp
‑
Gly
‑
Pro
‑
Ser
‑
Gly
‑
Pro
‑
Ala
‑
Gly
‑
Asp
‑
Arg。单链线性结构，分子量为1337.30，白色粉末状，易溶于水，对HT
‑
29细胞增殖有抑制作用。
[0008]与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术从鸡源III型胶原中获得并确定了胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR的活性与功效，其具有抑制HT
‑
29细胞增殖作用，易于被人体吸收，并且具有补充人体必须氨基酸的能力及营养功能，作为预防和治疗结肠炎或结肠癌有关的疾病的食品、保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。
附图说明
[0009]图1为胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR的一级质谱图；
图2为胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR的二级质谱图；图3为胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR抑制HT
‑
29细胞增殖的实验结果。
具体实施方式
[0010]下面结合实施例用于说明本专利技术作进一步详细的描述，但不用来限制本专利技术的范围。
[0011]实施例1 胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR的合成本专利技术利用多肽合成仪采用固相合成法合成胶原肽：称取0.05mmol Fmoc
‑
Ala
‑
Wang树脂（官能团含量0.33mmol/g)置于固相反应器中，加8mL DCM溶胀过夜，减压抽去溶剂。加入浓度为 200mL/L的哌啶溶液8mL，室温下反应5min，抽干 ；再加入浓度为200mL/L的哌啶溶液8mL，室温下反应20min，抽干；依次用8mL的DMF洗涤3次，每次lmin。准确量取0.2mmol的α
‑
氨基被Fmoc保护的氨基酸溶液、0.2mmol的HBTU溶液、0.195mmol的HOBT 溶液加入固相反应器中，反应5min后加入0.4mmol的DIEA，室温下氮气气泡振荡反应2h。依次用8mL的DMF洗涤3次，每次1min。加入浓度为200mL/L的哌啶溶液8mL，室温下反应5min，抽干；再加入浓度为200mL/L的哌啶溶液8mL，室温下反应20min，抽干；依次以8mL的 DMF洗涤3次，每次1min。按照如上步骤从肽链的碳端到氮端逐一连续合成了胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR。待合成完毕后，分别用DMF和DCM先后清洗连有多肽链的树脂，后将树脂至于真空干燥箱内干燥备用。
[0012]待树脂干燥后，将树脂转移至鸡心瓶中，加入磁子，在冰水浴下缓慢加入用于脱除树脂的切割液10mL(切割液中TFA :纯水:苯甲硫醚:苯酚:乙二硫醇比例为82.5:5:5:5:2.5)，冰水浴下反应2h。待反应完成，将反应液连同树脂一同转移至过滤器中，用水泵抽滤，将得到的滤液置于圆底烧瓶中，并在氮气流下吹干。待圆底烧瓶中的样品吹至粘稠，撤下氮气管，在圆底烧瓶中倒入约20mL的4℃冰乙醚，混合后充分打散，然后于冷冻离心机内，4℃下 8000r/min离心15min，弃上清，再于20mL的4℃冰乙醚中打散，离心；如此重复操作3次，将沉淀再次真空干燥，即得胶原肽。
[0013]用反向高效液相色谱法对胶原肽进行纯化鉴定。采用C18半制备柱，流动相:A相（水相) ：去离子水（含0.1% TFA(m/v)) ；B相(有机相）：80%乙腈水溶液（含0.1%TFA(m/v)) ；流速:6mL/min ；洗脱梯度：A相以每分钟1%的变化从55%降到10%，B相以每分钟1%的变化从45%升到90%。采集6
‑
8min 的洗脱液，采用旋转蒸发仪除去洗脱液中的有机相乙腈，之后将剩余的肽水溶液放入冰箱冷冻，最后用冷冻干燥机除去水分，得到蓬松固体粉末，为胶原肽纯品。图1为其一级质谱图，一级质谱中的信号为胶原肽母离子肽段信号。图2为胶原肽的二级质谱，该质谱图中包含了胶原肽的各种碎片离子信息的质荷比及丰度。
[0014]实施例2 胶原肽GSpGPpGPSGPAGDR抑制HT
‑
29细胞增殖活性检测将HT
‑
29细胞接种于平底96孔细胞培养板，每孔100μL，含5
×
104个细胞，使细胞贴壁，孵育培养24h后，用DMEM完全培养液稀释胶原肽，然后将稀释的药物加入96孔细胞培养板，胶原肽浓度设三个复孔，对照孔只加100μL细胞培养液。由于加药后，各孔总体积为100μL，胶原肽浓度为600 μg/mL。加药后，细胞继续培养24小时。
[0015]如无特殊说明，本专利技术所制备的胶原肽处理细胞24小时后，采用CCK
‑
8法检测细胞
生长情况。细胞培养完成后，吸出孔中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胶原肽，其特征在于：所述多肽为GSpGPpGPSGPAGDR；该多肽的氨基酸序列为Gly
‑
Ser
‑
Hyp
‑
Gly
‑
Pro
‑
Hyp
‑
Gly
‑
Pro
‑
Ser
‑
Gly
‑
Pro
‑
Ala
‑
Gly<...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄雅钦，邓贵雅，郭尚伟，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：