一种生物合成昆布二糖的方法技术

本发明专利技术涉及合成生物学领域，具体涉及一种生物合成昆布二糖的方法。本发明专利技术以非可食生物质纤维糊精为底物，经过多步级联酶催化反应合成具有药用价值的昆布二糖，本发明专利技术提供的昆布二糖合成路线拓展了纤维素生物质的应用范围，为生物质的高值化利用提供一定的基础。为生物质的高值化利用提供一定的基础。为生物质的高值化利用提供一定的基础。

【技术实现步骤摘要】
一种生物合成昆布二糖的方法


[0001]本专利技术属于合成生物学领域，具体涉及一种昆布二糖的新的生物合成方法。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]木质纤维素目前是世界上最丰富的可再生能源物质。目前木质纤维素主要通过微生物或者酶处理生成纤维素乙醇或其类似物。纤维二糖是木质纤维素特有的结构单元，纤维二糖可以被纤维二糖磷酸化酶(CBP)降解为葡萄糖
‑1‑
磷酸和葡萄糖，进而被酶或者微生物利用转化成为其他化合物。
[0004]昆布二糖(3
‑
O
‑
β
‑
D
‑
吡喃葡萄糖基
‑
D
‑
葡萄糖)是由两个葡萄糖单元β
‑
1,3糖苷键连接的还原性二糖。其可以作为重要药物硫酸多糖酯的合成前体，还可以作为防腐剂和重要的益生元。目前，昆布二糖主要通过β
‑
1,3
‑
葡聚糖部分酸水解获得，而化学合成需要解决多步的基团保护和脱保护步骤，导致了繁琐的纯化及较低的总收率。
[0005]专利技术人通过检索发现：现有的多酶级联催化来制备昆布二糖的方法中没有涉及纤维素和纤维素酶的应用。同时，现有的多酶级联催化在反应过程中添加了葡萄糖等反应物，没能实现在反应过程中，不添加其他底物的情况下，一锅法合成昆布二糖。

技术实现思路

[0006]为了克服上述问题，本专利技术的目的是提供一种多酶级联催化纤维糊精生物合成昆布二糖的方法。本专利技术通过对昆布二糖合成路径重新设计，通过三酶级联反应，实现了从非粮生物质合成昆布二糖，拓展了秸秆等农业废弃物的应用前景。
[0007]为实现上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]本专利技术的第一个方面，提供了一种生物合成昆布二糖的方法，包括：
[0009]以纤维糊精为底物，进行三酶级联反应合成昆布二糖；
[0010]其中，三酶级联反应液中包括：纤维糊精磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、昆布二糖磷酸化酶。
[0011]本专利技术共涉及三种酶，CDP(Cellodextrin phosphorylase,EC 2.4.1.49，纤维糊精磷酸化酶)，CBP(cellobiose phosphorylase，EC:2.4.1.20，纤维二糖磷酸化酶)和LBP(laminaribiose phosphorylase，EC:2.4.1.31，昆布二糖磷酸化酶)。构建的三酶级联反应，在不需要额外添加辅因子和底物的情况下，利用非可食生物质(纤维糊精)为底物，一锅法成功合成了昆布二糖，这是一种全新的昆布二糖合成路径，为纤维素生物质的高值化利用奠定基础。
[0012]本专利技术的第二个方面，提供了任一上述的方法制备的昆布二糖。
[0013]本专利技术的第三个方面，提供了纤维糊精在采用三酶级联反应合成昆布二糖中的应
用。
[0014]本专利技术以非可食的纤维糊精为底物，构建了体外多酶级联反应，实现了纤维素生物质合成高附加值功能性二糖昆布二糖的工艺。
[0015]本专利技术的有益效果在于：
[0016](1)经本专利技术的方法合成昆布二糖，不涉及ATP和其他反应中间物的添加，只需要加入纤维糊精和适量的磷酸根离子，加入三种酶，在合适的缓冲液、pH、温度下，直接合成昆布二糖。本专利技术提供的方法中，反应物更易获取且价格低廉，通过本方法，可以缓解目前中国的农业废弃物浪费问题，实现了资源再利用，具有良好的经济意义。
[0017](2)本专利技术的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。
附图说明
[0018]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0019]图1为本专利技术的技术路线图。
[0020]图2为本专利技术实施例1中SDS
‑
PAGE凝胶分析纯化后的CBP、LBP和CDP；
[0021]图3为本专利技术实施例1中CDP、CBP和LBP催化纤维糊精生产昆布二糖。
具体实施方式
[0022]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本专利技术使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0023]一种生物合成昆布二糖的方法，包括：
[0024]以纤维糊精为底物，进行三酶级联反应合成昆布二糖；
[0025]其中，三酶级联反应液中包括：纤维糊精磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、昆布二糖磷酸化酶。
[0026]在一些实施例中，所述纤维糊精的制备方法为：将微晶纤维素与浓盐酸和浓硫酸混合，进行反应，反应完成后，加水、固液分离，取上清液，加入丙酮，沉淀出可溶性纤维糊精；再用丙酮进行多次洗涤，收集沉淀物；将沉淀物溶解在水中，脱除丙酮，调节上清液至中性，固液分离，得到纤维糊精。
[0027]在一些实施例中，采用大肠杆菌表达系统表达纤维糊精磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶和昆布二糖磷酸化酶。
[0028]在一些实施例中，所述纤维糊精磷酸化酶的浓度为1.0～2.0mg/ml，优选地，为1.5mg/ml。
[0029]在一些实施例中，所述纤维二糖磷酸化酶的浓度为0.8～1.2mg/ml，优选地，为1mg/ml。
[0030]在一些实施例中，所述昆布二糖磷酸化酶的浓度为0.8～1.2mg/mlL，优选地，为1mg/mlL。
[0031]在一些实施例中，所述三酶级联反应液还包括：KH2PO4、Mg
2+
和柠檬酸缓冲液。
[0032]在一些实施例中，所述三酶级联反应的条件为45～55℃反应20～30h，优选地，为
50℃反应24h。
[0033]实验所需溶液配制：
[0034](1)高效液相色谱流动相溶液：5mM H2SO4溶液，用ddH2O配制。
[0035](2)8％SDS
‑
PAG分离胶(10mL)：Tris
‑
HCl(1.5M,pH 8.8)：2.6mL，丙烯酰胺溶液(30％)：2.6mL，SDS(10％)：0.1mL，APS(10％)：0.1mL，TEMED：6μL，ddH2O：4.6mL。
[0036](3)5％SDS
‑
PAG浓缩胶(4mL)：Tris
‑
HCl(1.5M,pH 8.8)：0.5mL，丙烯酰胺溶液(30％)：0.67mL，SDS(10％)：40μL，APS(10％)：40μL，TEMED：4μL，ddH2O：2.7mL。
[0037](4)5
×
SDS电泳缓冲液(1L)：Tris
‑
HCl：15.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物合成昆布二糖的方法，其特征在于，包括：以纤维糊精为底物，进行三酶级联反应合成昆布二糖；其中，三酶级联反应液中包括：纤维糊精磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、昆布二糖磷酸化酶。2.如权利要求1所述的生物合成昆布二糖的方法，其特征在于，所述纤维糊精的制备方法为：将微晶纤维素与浓盐酸和浓硫酸混合，进行反应，反应完成后，加水、固液分离，取上清液，加入丙酮，沉淀出可溶性纤维糊精；再用丙酮进行多次洗涤，收集沉淀物；将沉淀物溶解在水中，脱除丙酮，调节上清液至中性，固液分离，得到纤维糊精。3.如权利要求1所述的生物合成昆布二糖的方法，其特征在于，采用大肠杆菌表达系统表达纤维糊精磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶和昆布二糖磷酸化酶。4.如权利要求1所述的生物合成昆布二糖的方法，其特征在于，所述纤维糊精磷酸化酶的浓度为1.0～2.0mg/ml，优选...

【专利技术属性】
技术研发人员：方诩，杜志强，刘正垚，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：