一种基于拉曼效应的微生物浓度快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于拉曼效应的微生物浓度快速检测方法，首先制备4

【技术实现步骤摘要】
一种基于拉曼效应的微生物浓度快速检测方法


[0001]本专利技术属于细菌检测分析领域，涉及一种细菌快速检测技术，具体涉及一种基于拉曼效应的微生物浓度快速检测方法。

技术介绍

[0002]细菌感染尤其是院内感染可导致许多严重甚至致命的疾病，已成为一种广泛而重要的公共卫生威胁。自1928年发现青霉素以来，抗生素在临床抗感染治疗中得到广泛应用，使得细菌性感染治疗取得巨大成就。然而，随着近几十年抗生素的滥用，抗生素耐药性已成为抗生素治疗的严重威胁。除了实施严格的卫生条例来缓解这一困境外，开发有效的细菌检测和杀灭技术是限制细菌传播和减少潜在损害的有效途径。
[0003]三键拉曼报告分子在生物拉曼透明区(1800
‑
2800cm
‑1)具有强烈而独特的拉曼振动，有效地避开了生物内源性分子的拉曼信号干扰，提高了生物应用中拉曼定量检测的准确性。一些含有各种三键(如C≡C键,C≡N键和C≡O键)基团的有机小分子或高分子大分子已发展成为细胞成像和细菌检测的拉曼标签。近年来，含有高密度三键基团的聚合物纳米粒子被合成为拉曼活性纳米材料并用于生物成像。在没有贵金属纳米粒子作为拉曼信号增强基底的情况下，聚合物纳米粒子可以实现在单个纳米粒子中产生强烈的拉曼信号，从而实现在活细胞和动物体内的拉曼高光谱检测和成像。
[0004]细菌检测后的及时杀灭对于防止造成环境二次污染至关重要。在众多的抗菌材料中，银离子由于具有安全、高效、广谱、无耐药性等特点，一直是抗菌领域的一个研究热点。银离子的杀菌原理是银离子作用于细菌的细胞壁和细胞膜并使之肿胀、疏松、通透性增加、内容物流出，导致细菌死亡。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供了一种基于拉曼效应的微生物浓度快速检测方法。本专利技术合成的聚合物纳米粒子，灵敏度高、重现性稳定性好、在150
‑
1500μM浓度范围与银离子浓度具有良好的线性关系，可用于快速检测并及时杀灭空气中的细菌。
[0006]为了实现本专利技术目的，本专利技术通过乳液聚合的方法合成4
‑
氰基苯乙烯聚合物纳米粒子，并结合Ag
+
可以有效增强4
‑
氰基苯乙烯聚合物纳米粒子的拉曼信号并且可以快速杀菌的特性，实现对空气中细菌的快速检测及杀灭。具体技术方案如下：
[0007]本专利技术提供一种基于拉曼效应的微生物浓度快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0008]S1：制备4
‑
氰基苯乙烯的聚合物纳米粒子乳液；
[0009]S2：获取待检测细菌浓度与拉曼信号强度的标准曲线，具体步骤如下：
[0010]S2.1、将含有已知细菌数量的标准菌液与过量的4
‑
巯基苯硼酸混合孵育，然后离心收集菌体，去除多余的4
‑
巯基苯硼酸，得到与4
‑
巯基苯硼酸饱和结合的标准菌体；
[0011]S2.2、将与4
‑
巯基苯硼酸饱和结合的菌体稀释不同倍数，得到不同浓度的细菌溶
液；
[0012]S2.3、将不同浓度的细菌溶液与已知浓度的银离子溶液共育，部分银离子通过4
‑
巯基苯硼酸为中介与细菌结合在一起；
[0013]S2.4、将步骤S2.3中共育后的混合溶液离心，得到上层清液，将上层清液与步骤S1中得到的聚合物纳米粒子乳液混合后进行拉曼检测，得到不同浓度细菌溶液对应的拉曼强度，建立细菌浓度与拉曼强度之间的标准曲线；
[0014]S3、细菌浓度检测，具体步骤如下：
[0015]S3.1、取已知体积的待检测细菌溶液，将待检测细菌溶液与过量的4
‑
巯基苯硼酸混合孵育，然后离心收集菌体，去除多余的4
‑
巯基苯硼酸，得到与4
‑
巯基苯硼酸饱和结合的待检测菌体；
[0016]S3.2、将待检测菌体重悬于已知量水中，得到待检测细菌溶液；
[0017]S3.3、将待检测细菌溶液与已知浓度的银离子溶液共育，部分银离子通过4
‑
巯基苯硼酸为中介与细菌结合在一起；
[0018]S3.4、将步骤S3.3中共育后的混合溶液离心，得到上层清液，将上层清液与聚合物纳米粒子乳液混合后进行拉曼检测，得到拉曼强度，根据步骤S2.4建立的标准曲线即可得到步骤S3.2中细菌溶液浓度，根据已知的水量计算细菌的数量，根据细菌数量计算出步骤S3.1中所取待检测细菌溶液的浓度。
[0019]进一步地，步骤S1中制备聚合物纳米粒子乳液方法为：
[0020]步骤1.1、以4
‑
氰基苯乙烯作为单体，在惰性气体氛围和过氧化物引发剂引发下进行聚合，得到4
‑
氰基苯乙烯聚合物；
[0021]步骤1.2、对步骤1.1得到的4
‑
氰基苯乙烯聚合物进行透析，得到聚合物纳米粒子乳液。
[0022]进一步地，步骤1.1中具体方式为：将4
‑
氰基苯乙烯加入反应容器中，然后向反应容器中加入水，在室温下搅拌20
‑
40分钟，之后往反应容器中通入高纯度氮气，并对反应容器水浴升温至60
‑
80℃，然后加入过硫酸钾溶液作为引发剂，反应1
‑
2h后冷却至室温，得到4
‑
氰基苯乙烯聚合物。
[0023]进一步地，步骤S1.2中，采用截留分子量为3500Da的透析袋对4
‑
氰基苯乙烯聚合物进行透析。
[0024]进一步地，步骤S1中，所述引发剂为过氧化物引发剂，更优的为无机氧化物引发剂，最优的为过硫酸钾溶液。
[0025]步骤S1中，4
‑
氰基苯乙烯的用量为40
‑
60mg；去离子水的用量为7
‑
10mL，室温下搅拌时间为20
‑
40分钟，过硫酸钾溶液浓度为8
‑
12mg/mL，用量为0.5
‑
1.5mL，加入过硫酸钾溶液后反应时间文1
‑
2h。
[0026]进一步地，步骤S2.1中，所述标准菌液中的细菌数量通过平板计数确定。
[0027]进一步地，步骤S2.1中，混合孵育的具体方式为，先将标准菌液稀释到固定浓度，然后离心收集菌体，之后将收集的菌体与巯基苯硼酸乙醇溶液重悬于水中，重悬液于细菌活性温度下孵育10
‑
20min，再次离心收集，得到经过4
‑
巯基苯硼酸饱和结合的标准菌体。
[0028]进一步地，步骤S2中，所述银离子为硝酸银溶液，4
‑
巯基苯硼酸溶液浓度为1
‑
3mM，加入4
‑
巯基苯硼酸溶液后孵育时间为10
‑
20min，4
‑
巯基苯硼酸作用后的细菌与银离子溶液
作用时间为5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于拉曼效应的微生物浓度快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：制备4
‑
氰基苯乙烯的聚合物纳米粒子乳液；S2：获取待检测细菌浓度与拉曼信号强度的标准曲线，具体步骤如下：S2.1、将含有已知细菌数量的标准菌液与过量的4
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巯基苯硼酸混合孵育，然后离心收集菌体，去除多余的4
‑
巯基苯硼酸，得到与4
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巯基苯硼酸饱和结合的标准菌体；S2.2、将与4
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巯基苯硼酸饱和结合的菌体稀释不同倍数，得到不同浓度的细菌溶液；S2.3、将不同浓度的细菌溶液与已知浓度的银离子溶液共育，部分银离子通过4
‑
巯基苯硼酸为中介与细菌结合在一起；S2.4、将步骤S2.3中共育后的混合溶液离心，得到上层清液，将上层清液与步骤S1中得到的聚合物纳米粒子乳液混合后进行拉曼检测，得到不同浓度细菌溶液对应的拉曼强度，建立细菌浓度与拉曼强度之间的标准曲线；S3、细菌浓度检测，具体步骤如下：S3.1、取已知体积的待检测细菌溶液，将待检测细菌溶液与过量的4
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巯基苯硼酸混合孵育，然后离心收集菌体，去除多余的4
‑
巯基苯硼酸，得到与4
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巯基苯硼酸饱和结合的待检测菌体；S3.2、将待检测菌体重悬于已知量水中，得到待检测细菌溶液；S3.3、将待检测细菌溶液与已知浓度的银离子溶液共育，部分银离子通过4
‑
巯基苯硼酸为中介与细菌结合在一起；S3.4、将步骤S3.3中共育后的混合溶液离心，得到上层清液，将上层清液与聚合物纳米粒子乳液混合后进行拉曼检测，得到拉曼强度，根据步骤S2.4建立的标准曲线即可得到步骤S3.2中细菌溶液浓度，根据已知的水量计算细菌的数量，根据细菌数量计算出步骤S3.1中所取待检测细菌溶液的浓度。2.根据权利要求1所述的微生物浓度快速检测方法，其特征在于；步骤S1中制备聚合物纳米粒子乳液方法为：步骤1.1、以4
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氰基苯乙烯作为单体，在惰性气体氛围和过氧化物引发剂引发下进行聚合，得到4
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氰基苯乙烯聚合物；步骤1.2、对步骤1.1得到的4
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：张鑫，沈爱国，
申请(专利权)人：沈爱国，
类型：发明
国别省市：