一种可以进入肿瘤细胞内的RGD-抗p21Ras单链抗体融合蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种可以进入肿瘤细胞内的RGD

【技术实现步骤摘要】
一种可以进入肿瘤细胞内的RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，更具体的涉及一种可以进入肿瘤细胞内的RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白及其制备方法。

技术介绍

[0002]ras基因是一种重要的细胞原癌基因，其命名来自大鼠肉瘤的英文rat asrcoma。ras基因家族包括三个主要成员：H
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ras，K
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ras及N
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ras，其分别定位于第12，11以及1号染色体，编码由188
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189个氨基酸组成的分子量约为21KD的蛋白质，三种Ras蛋白的氨基酸序列同源性为85％。
[0003]Ras蛋白作为极其重要的信号传导传递蛋白调节细胞的正常分化及增殖。Ras蛋白在合成后，其羧基端必须经过复杂的翻译后修饰，使其准确的定位于细胞膜的内侧面才能发挥其生物学功能。Ras蛋白在细胞外生长信号刺激下与GTP结合成为活性状态的Ras
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GTP形式，从而激活Ras蛋白下游众多信号通道，促进细胞分裂，增生和恶性转化。
[0004]当ras基因发生突变或过表达时，与GTP结合成为活性状态，导致细胞恶性转化并促进恶性肿瘤细胞的浸润及转移。研究表明，大约30％的人类肿瘤中存在ras基因突变或ras基因的过表达。
[0005]利用基因工程技术构建的单链抗体是用柔性寡核苷酸片段连接完整抗体的可变区构建的线性片段，分子量只有完整抗体的1/6，渗透力强，在非靶向组织中滞留时间短、易从体内清除。而且由于没有全抗体的Fc片段，免疫源性低，用于人体几乎不会产生抗鼠抗体反应。这种抗体通过与细胞内特定蛋白的结合使其失活，阻断其与其他蛋白的相互作用，或干扰该蛋白的正常胞内定位，从而阻止其发挥正常生物学功能。
[0006]本专利技术利用小鼠抗体轻、重链混合引物，从经过Ras蛋白免疫后的Balb/c小鼠脾B淋巴细胞中扩增获得其轻、重链可变区基因片段。通过重叠延伸PCR技术，将柔性寡核苷酸和所述两片段连接，构建出抗p21Ras蛋白的单链抗体基因片段。为了制备可以特异进入肿瘤细胞的抗p21Ras单链抗体，本专利技术在前期基础上将RGD穿膜肽和抗p21Ras单链抗体基因构建为融合表达基因，并对RGD
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抗p21Ras单链抗体融合基因的密码子进行优化，将优化后的RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因克隆至pET
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32a原核表达载体，再将重组表达载体转入Origami(DE3)大肠杆菌表达菌中，构建出RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白重组表达系统。经过一系列表达及纯化条件的摸索，制备出能够穿透肿瘤细胞膜、抑制肿瘤生长的RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服上述的不足，提供一种可以进入肿瘤细胞内的RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0008]该RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白是由RGD穿膜肽、重链可变区、连接肽和轻链可
变区组成的融合多肽；所述连接肽位于所述重链可变区与所述轻链可变区之间SEQ ID NO：2中第136
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150位氨基酸序列。RGD穿膜肽序列位于SEQ ID NO：2中第1
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11位氨基酸序列。
[0009]本专利技术的目的还在于提供了一种RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白重组表达质粒，该重组表达质粒由RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因克隆至原核表达质粒pET
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32a的Kpn I和Hind III酶切位点之间而成。所述RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因如SEQ ID NO：1所示。
[0010]本专利技术的目的还在于提供了一种RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白的原核表达系统，该原核表达系统由上述重组表达质粒转化到大肠杆菌表达菌Origami(DE3)而成。
[0011]本专利技术的目的还在于提供了一种RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白的发酵罐诱导表达条件，可以用于大规模发酵生产表达融合蛋白。
[0012]本专利技术的目的还在于提供了一种RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白的纯化方法，即先超声破碎重组表达菌，离心收集以包涵体形式存在的RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白，经过包涵体洗涤液洗涤后，使用含8M尿素的变性剂使其变性，利用镍离子亲和层析柱和AKTA系统纯化变性后的包涵体融合蛋白，最后采用尿素梯度透析复性的方法使变性的融合蛋白重新折叠，恢复其生物活性，达到纯化蛋白的目的。
[0013]本专利技术所述RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白能广谱拮抗H
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Ras、K
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Ras、N
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Ras三种p21Ras蛋白；该融合蛋白能够穿透高表达整合素的肿瘤细胞的细胞膜从而进入肿瘤细胞内而无法穿透正常细胞的细胞膜进入正常细胞中，可用于ras基因相关肿瘤的诊断性研究、发病机制研究或治疗性研究。
[0014]本专利技术的上述目的通过如下方案实现：
[0015]本专利技术通过在抗p21Ras单链抗体的N端增加RGD肽序列，使其具有能够特异性穿透肿瘤细胞膜，从而与肿瘤细胞内的p21Ras蛋白结合，阻断ras信号通路的能力。
[0016]本专利技术通过优化了RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因的密码子，改变了原有融合蛋白的DNA序列，使其密码子序列更适合在大肠杆菌中表达，提高了RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白在大肠杆菌中的表达量。
[0017]本专利技术通过实验确定了RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白的原核表达质粒和大肠杆菌表达菌株的最佳组合。
[0018]本专利技术通过实验确定了RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白的最佳诱导表达条件，并通过AKTA层析系统确定了镍离子亲和层析纯化RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白的最佳条件，进一步的提高了蛋白的表达量和蛋白纯度。
[0019]本专利技术所述的一种可以特异性进入肿瘤细胞内的RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白及其制备方法，所述融合蛋白的制备方法如下：
[0020]1.抗p21Ras单链抗体基因的构建
[0021](1)利用小鼠抗体轻、重链混合引物，从经过p21Ras蛋白免疫后的Balb/c小鼠脾B淋巴细胞多重扩增获得其轻、重链可变区基因片段。通过重叠延伸PCR，将柔性寡核苷酸链(lin本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白的DNA分子或基因，其特征在于：编码RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种原核重组表达载体，其特征在于：含有权利要求1所述的DNA分子或基因片段，并将编码RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白的基因片段克隆至原核表达载体pET
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32a的Kpn I和Hind III限制性内切酶识别位点之间。3.一种原核重组表达菌株，其特征在于：它由权利要求2所述的原核重组表达载体经过化学转化或电转化至大肠杆菌Origami(DE3)感受态中而成，并能够表达RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白。4.一种制备RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：a)将权利要求1所述RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白基因按照大肠杆菌宿主细胞的密码子偏好进行密码子优化后，克隆至原核表达载体pET
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32a中，构建重组原核表达载体；b)将步骤a)所述重组原核表达载体转化宿主细胞Origami(DE3)感受态中；c)通过自诱导培养基在发酵罐中诱导重组原核表达菌株表达RGD
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抗p21Ras单链抗体融合蛋白，发酵条件为：取pET32a
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RGD
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p21Ras scfv/Ori...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨举伦，冯强，黄晨晨，刘芳枘，潘鑫艳，
申请(专利权)人：中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院，
类型：发明
国别省市：