含dHAM的复合静电纺丝纤维膜及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了含dHAM的复合静电纺丝纤维膜及其制备方法和应用，属于组织工程领域。该复合静电纺丝纤维膜的制备方法包括：羊膜清洗和脱细胞预处理得到dHAM，采用冻干研磨和消化透析的增溶步骤制备可溶dHAM粉末，以HFIP作为静电纺丝溶剂配制共混/同轴PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝溶液，在环境湿度为30％

【技术实现步骤摘要】
含dHAM的复合静电纺丝纤维膜及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于组织工程领域，具体涉及含dHAM的复合静电纺丝纤维膜及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]盆腔器官脱垂(Pelvic organ prolapse，POP)常见于中老年妇女，由于盆底提肛肌群和结缔组织等支撑结构衰弱引起的器官下坠、脱出致结构及功能病变，是盆底功能障碍这类多因素疾病(Pelvic floor dysfunction，PFD)的一种病症。PFDs是一种常见病，在美国约25％的妇女受PFDs的影响倍感压力，我国有POP临床表现的成年女性高达9.6％，女性因POP等疾病导致的手术风险约20％，可谓妇科手术的常见原因。临床中，盆底重建手术是一种疗效较好、满意度高的治疗策略。
[0003]组织工程是一门修复、重建损伤组织的技术，包括支架、种子细胞以及细胞因子三个要素，具体步骤为：具有分化能力的种子细胞种植在可降解的生物相容材料上，形成复合生物网片并植入待修复部位，网片瓦解的同时与周边组织融合成新组织，达到修复重建效果。组织工程中支架是关键要素，它提供足够的空间用于组织和器官再生，支架材料和制备方法的选择直接关系到细胞和生长因子与特定组织的相互作用，关系到材料植入及后续损伤组织功能修复和改善的效果。以生物可降解聚合物为原料制备的支架材料广泛用于组织工程，但原料高昂的制造成本、不理想的生物活性仍促使研究人员寻找更好的原料替代品。近年来，组织工程方法在POP治疗领域有巨大潜力，在重建医学领域中新型组织工程生物网片得到研究者的青睐，随着对女性盆底功能解剖学的认识加深及改善盆底重建手术并发症的需求增多，使修复网片的应用更加广泛。不能降解聚丙烯网片作为盆底重建手术的常用合成材料之一，曾被认为是修复网片设计的理想模型，但其植入后易产生如网片暴露穿孔、感染甚至流血等并发症，美国食品药品监督管理局于2011年发布的安全通报更新也证明这一点。因此，应用于盆底重建的组织工程也面临选择理想生物材料、最佳种子细胞和相关诱导因子以及设计合适支架等方面的挑战。

技术实现思路

[0004]本专利技术的第一目的是提供一种含dHAM的复合静电纺丝纤维膜的制备方法，采用静电纺丝技术，在高压静电下将PCL、PLGA与dHAM结合得到由微米级纤维有序排列构成的PCL/PLGA/dHAM静电纺丝膜，充分保留PCL和PLGA物化特性的同时，创新性地将人羊膜用于静电纺丝，理化特性及生物相容性良好，对hUC
‑
MSCs无明显细胞毒性，用于POP具有潜在的临床应用价值。
[0005]本专利技术的第二目的是提供一种通过上述制备方法得到的含dHAM的复合静电纺丝纤维膜。
[0006]本专利技术的第三目的是提供上述含dHAM的复合静电纺丝纤维膜在盆腔器官脱垂组织工程中的应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]本专利技术提供的含dHAM的复合静电纺丝纤维膜的制备方法，包括以下步骤：
[0009](1)羊膜清洗和脱细胞预处理，得到dHAM；
[0010](2)采用包含冻干研磨、消化透析和二次冻干研磨的增溶步骤制备可溶dHAM粉末；
[0011](3)以六氟异丙醇(HFIP)作为静电纺丝溶剂配制共混PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝溶液或同轴PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝液；
[0012](4)连接静电纺丝装置，打开电源，步骤(3)得到的静电纺丝溶液在环境湿度为30％
–
50％、温度为25
–
35℃的条件下进行共混静电纺丝或同轴静电纺丝，得到微米级纤维有序排列的含dHAM的复合静电纺丝纤维膜，通风静置，待表面溶剂挥发后真空保存。
[0013]优选地，步骤(1)中，所述羊膜清洗和脱细胞预处理包括以下步骤：
[0014](1
–
1)新鲜的人羊膜样本在超净工作台中平铺，用去离子水配制的PBS溶液清洗、去除血污后，用75％乙醇漂洗至半透状态；
[0015](1
–
2)放入含有10％双抗的PBS溶液中浸泡，同时磁力搅拌漂洗震荡，每间隔12h更换所述含有10％双抗的PBS溶液，共换2次；
[0016](1
–
3)放入占PBS重量1％的表面活性剂Triton
‑
100溶液中浸泡，每间隔8h更换所述占PBS重量1％的表面活性剂Triton
‑
100溶液，共换2次；
[0017](1
–
4)放入含有1000U胰脂酶/L的PBS溶液中浸泡，37℃震荡24h，取出清洗；
[0018](1
–
5)放入含有1000U DNA酶/L的PBS溶液中浸泡，37℃震荡24h，取出清洗；
[0019](1
–
6)放入含有10％双抗的PBS溶液中漂洗，每间隔12h更换，共换2次，得到dHAM，4℃存于含有双抗的PBS溶液中备用。
[0020]优选地，步骤(2)中，所述可溶dHAM粉末的制备方法包括：
[0021](2
–
1)取步骤(1)得到的dHAM，剪成适当大小平铺在培养皿中，盖一层有孔的保鲜膜，预先置于
‑
80℃中彻底冷冻，迅速转至真空冻干机中冷冻干燥48h，得到冻干dHAM；将冻干dHAM置于
‑
198℃的冷冻研磨机中，30Hz研磨3次，每次30s，迅速转移到5mL离心管中，得到可通过50目筛的不溶dHAM粉末；
[0022](2
–
2)取1g不溶dHAM粉末加入20mL的含有HCl(0.5M)和胃蛋白酶(≥1600U/L)的水溶液中进行消化，在4℃和200r/min的条件下连续搅拌3天，使之获得可溶性，用NaOH(4N)中和至pH为7.4，配制成dHAM悬浮液，去离子水透析24h，每4h换一次去离子水，得到乳白色的dHAM粘性溶液；
[0023](2
–
3)消化后的dHAM粘性溶液置于培养皿，盖有孔保鲜膜于
‑
80℃中彻底冷冻，迅速转至真空冻干机中冷冻干燥48h，得到冻干可溶dHAM；将冻干可溶dHAM置于
‑
198℃的冷冻研磨机中，30Hz研磨3次，每次30s，迅速转移到5mL离心管中，得到可通过50目筛的可溶dHAM粉末。
[0024]优选地，步骤(3)中，所述共混PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝液的配制方法为：静电纺丝溶剂HFIP为10mL，称3g的PCL加入，以300
–
3000rpm速度磁力搅拌至溶解，12h后得浓度为30％的PCL静电纺丝液，采用同样的方法得到浓度为15％的PLGA静电纺丝液和5％的dHAM静电纺丝液，将PCL、PLGA、dHAM以1：1：1的比例搅拌混匀得到；
[0025]和/或所述同轴PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝液的配制方法为：静电纺丝溶剂HFIP为10mL，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.含dHAM的复合静电纺丝纤维膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)羊膜清洗和脱细胞预处理，得到dHAM；(2)采用包含冻干研磨、消化透析和二次冻干研磨的增溶步骤制备可溶dHAM粉末；(3)以六氟异丙醇(HFIP)作为静电纺丝溶剂配制共混PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝溶液或同轴PLGA/PCL/dHAM复合静电纺丝溶液；(4)连接静电纺丝装置，打开电源，步骤(3)得到的静电纺丝溶液在环境湿度为30％
–
50％、温度为25
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35℃的条件下进行共混静电纺丝或同轴静电纺丝，得到微米级纤维有序排列的含dHAM的复合静电纺丝纤维膜。2.根据权利要求1所述含dHAM的复合静电纺丝纤维膜的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述羊膜清洗和脱细胞预处理包括：(1
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1)新鲜的人羊膜样本在超净工作台中平铺，用去离子水配制的PBS溶液清洗、去除血污后，用75％乙醇漂洗至半透状态；(1
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2)放入含有10％双抗的PBS溶液中浸泡，同时磁力搅拌漂洗震荡，每间隔12h更换所述含有10％双抗的PBS溶液，共换2次；(1
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3)放入占PBS重量1％的表面活性剂Triton
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100溶液中浸泡，每间隔8h更换所述占PBS重量1％的表面活性剂Triton
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100溶液，共换2次；(1
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4)放入含有1000U胰脂酶/L的PBS溶液中浸泡，37℃震荡24h，取出清洗；(1
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5)放入含有1000U DNA酶/L的PBS溶液中浸泡，37℃震荡24h，取出清洗；(1
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6)放入含有10％双抗的PBS溶液中漂洗，每间隔12h更换，共换2次，得到dHAM，4℃存于含有双抗的PBS溶液中备用。3.根据权利要求1所述含dHAM的复合静电纺丝纤维膜的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述可溶dHAM粉末的制备方法包括：(2
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1)取步骤(1)得到的dHAM，剪成适当大小平铺在培养皿中，盖一层有孔的保鲜膜，预先置于
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80℃中彻底冷冻，迅速转至真空冻干机中冷冻干燥48h，得到冻干dHAM；将冻干dHAM置于
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198℃的冷冻研磨机中，30Hz研磨3次，每次30s，迅速转移到5mL离心管中，得到可通过50目筛的不溶dHAM粉末；(2
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2)取1g不溶dHA...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘克海，杨德宇，宋孟迪，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：