一种脱细胞脂肪基质的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种脱细胞脂肪基质的制备方法。属于医用生物材料技术领域。包括以下步骤：脂肪组织保存处理；冻融程序处理；分离油脂；除垢；去除细胞和水解；萃取；清洗沥干，得脱细胞脂肪基质。本发明专利技术材料洁净无杂质，含有脱细胞脂肪支架的主要活性成分，无免疫反应，且物理性能优，机械性能佳，能够较好的应用于软组织损伤修复。组织损伤修复。组织损伤修复。

【技术实现步骤摘要】
一种脱细胞脂肪基质的制备方法


[0001]本专利技术涉及医用生物材料
，更具体的说是涉及一种脱细胞脂肪基质的制备方法。

技术介绍

[0002]软组织缺损是临床工作中的常见疾病，组织再生是解决这一问题的关键，组织工程与再生医学技术的兴起为组织再生提供一种可行的方案。研究表明，干细胞自我更新和不断分化的特性能够实现组织代谢和创伤后缺陷的再生，是组织再生的理想细胞。随着干细胞用于组织再生的不断发展，随之而来的各种问题也不断出现：1)干细胞体外扩增端粒缩短问题。2)干细胞体外扩增功能受损问题。3)干细胞污染问题。4)干细胞不稳定、存活率低的问题。
[0003]干细胞增殖和分化的动态和特异性微环境称为生态位，生态位的变化是制约干细胞应用的关键因素。正常情况下，细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)是调节干细胞命运的理想环境。ECM由多种胶原、糖蛋白和生长因子组成，通过与干细胞相互作用，动态调控干细胞的行为，为干细胞识别提供细胞外线索。
[0004]在组织工程和再生医学领域中，利用干细胞实现组织再生，生物材料支架是关键。新兴的生物支架材料是未来组织工程和再生医学发展的一个重要方向。ECM可能是最理想的生物材料支架，然而，天然的ECM来源于组织，往往含有活细胞等免疫原，是阻碍ECM应用于组织工程和再生医学领域的关键因素。脱细胞技术的出现及快速发展极大地推动ECM在干细胞领域的应用。生物组织经过脱细胞处理后，去除组织中的免疫原成分，保留了完整的ECM结构，并含有干细胞生存、增殖和迁移以及特定谱系分化的生长因子和其他生化成分。不同于合成支架，脱细胞化的组织基质支架通过影响细胞分化和组织重塑的能力能够积极地与植入其上的细胞沟通，是组织工程的优越生物材料。目前，基于脱细胞组织的支架已经从真皮，肠粘膜、软骨、膀胱，心包和脂肪等组织中产生。这些支架广泛应用于在乳房重建、粘膜缺损、创面愈合、软组织填充等领域。
[0005]人同种异体组织可能是ECM的最理想来源。人脂肪组织脱细胞基质是临床应用有前途的支架，它可以作为脂肪组织移植的非免疫原性替代物，以增强或重建软组织。人脂肪组织来源丰富，与其他人体组织不同，脂肪切除，腹部整形，乳房缩小术或抽脂后获得的人体脂肪组织往往作为医疗废物丢弃。通过脱细胞技术从脂肪组织中获得ECM，变废为宝，能够极大的降低医疗资源的浪费。
[0006]因此，如何提供一种脱细胞彻底，无免疫原性，无细胞毒性，生物相容性好的脱细胞脂肪基质是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供了一种脱细胞脂肪基质的制备方法。联合物理、化学和生物方法制备脱细胞脂肪基质。生物相容性好，免疫原性低，含有丰富的活性成分(主要为细胞
因子)。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]一种脱细胞脂肪基质的制备方法，包括以下步骤：
[0010]1)脂肪组织保存处理：将新鲜离体的脂肪组织A置于无菌预冷的生理盐水保存液中，得脂肪组织B；
[0011]2)将脂肪组织B冻融程序处理；
[0012]3)将冻融程序处理后的脂肪组织分离油脂；
[0013]4)将分离油脂后的脂肪组织除垢，得脂肪组织C清洗沥干；
[0014]5)脂肪组织C去除细胞和水解得脂肪组织D，清洗沥干；
[0015]6)脂肪组织D萃取，得脂肪组织E；
[0016]7)脂肪组织E清洗沥干，得脱细胞脂肪基质。
[0017]进一步的，预冷温度为4℃。
[0018]进一步的：步骤4)清洗沥干为ddH2O中反复清洗，重复3次，沥干水分。
[0019]步骤5)清洗沥干为生理盐水中反复清洗，重复3次，沥干水分。
[0020]进一步的，步骤7)清洗沥干为置于生理盐水中反复清洗3～6次，沥干水分。
[0021]优选的：步骤1)所述生理盐水保存液为含5％血清白蛋白的无菌0.9％wt生理盐水。
[0022]优选的：步骤2)所述冻融程序：液氮冷冻10～15min，再升温至25～37℃，重复3次。
[0023]有益效果在于：使组织融化变软。
[0024]优选的：步骤3)分离油脂：先将脂肪组织制备成小块：4℃环境下，利用手术刀片将脂肪组织切成2cm
×
2cm
×
1cm的小块；再机械分离：将分离成块的脂肪组织置于破壁机中加入预冷ddH2O搅拌10～20min。
[0025]有益效果在于:更易去除油脂，此过程在4℃冷库中进行。
[0026]优选的：步骤4)所述除垢：加入TritonX
‑
100溶液，不断搅拌过夜，离心；所述分离油脂后的脂肪组织和TritonX
‑
100溶液按照体积比为0.5～1：2～4；所述TritonX
‑
100的浓度：1～3％wt；所述搅拌：温度25～30℃，500～800rp m，期间更换溶液2～3次；所述离心：2～4℃环境下，转速3000～5000rpm，时间10～20min。
[0027]有益效果在于：TritonX
‑
100是一种较温和的非离子除垢剂，不改变组织的天然结构，
[0028]优选的：步骤5)所述去除细胞和水解：将脂肪组织C按体积比0.5～1：2～4加入Trypsin
–
EDTA溶液和脂肪分解酶混合液，不断搅拌，消化过夜；所述Trypsin
–
EDTA溶液：0.25％trypsin
–
0.05％EDTA溶液；所述脂肪分解酶液：2.5～5mg/ml脂肪酶溶液；所述搅拌，消化过夜：温度25～37℃，500～800rpm，期间更换溶液2～3次。
[0029]有益效果在于：进一步去除细胞和脂肪组织中的脂肪。
[0030]优选的：步骤6)所述萃取加入异丙醇萃取；所述脂肪组织D和异丙醇按照体积比为0.5～1：2～3；所述萃取需不断搅拌，期间更换溶液2～3次。
[0031]本专利技术还提供了上述一种脱细胞脂肪基质的制备方法制备得到的脱细胞脂肪基质。
[0032]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种脱细胞脂肪
基质的制备方法，相较于现有技术本专利技术材料洁净无杂质，含有脱细胞脂肪支架的主要活性成分，无免疫反应，且物理性能优，机械性能佳，能够较好的应用于软组织损伤修复。
附图说明
[0033]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0034]图1附图为本专利技术提供的脱细胞脂肪基质观察图，其中，左图为脂肪组织，右图为脱细胞脂肪基质。
[0035]图2附图为本专利技术提供的DAPI染色本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脱细胞脂肪基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)脂肪组织保存处理：将新鲜离体的脂肪组织A置于无菌预冷的生理盐水保存液中，得脂肪组织B；2)将脂肪组织B冻融程序处理；3)将冻融程序处理后的脂肪组织分离油脂；4)将分离油脂后的脂肪组织除垢，得脂肪组织C清洗沥干；5)脂肪组织C去除细胞和水解得脂肪组织D，清洗沥干；6)脂肪组织D萃取，得脂肪组织E；7)脂肪组织E清洗沥干，得脱细胞脂肪基质。2.根据权利要求1所述的一种脱细胞脂肪基质的制备方法，其特征在于：步骤1)所述生理盐水保存液为含5％血清白蛋白的无菌0.9％wt生理盐水。3.如权利要求1所述的一种脱细胞脂肪基质的制备方法，其特征在于，步骤2)所述冻融程序：液氮冷冻10～15min，再升温至25～37℃，重复3次。4.根据权利要求1所述的一种脱细胞脂肪基质的制备方法，其特征在于：步骤3)分离油脂：先将脂肪组织制备成小块：4℃环境下，利用手术刀片将脂肪组织切成2cm
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2cm
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1cm的小块；再机械分离：将分离成块的脂肪组织置于破壁机中加入预冷ddH2O搅拌10～20min。5.根据权利要求1所述的一种脱细胞脂肪基质的制备方法，其特征在于：步骤4)所述除垢：加入TritonX
‑
100溶液，不...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨屈杨，朱宁文，
申请(专利权)人：英中再生医学山东有限公司，
类型：发明
国别省市：