一种新型布鲁氏菌抗体检测方法技术

本发明专利技术属于布鲁氏菌抗体检测技术领域，尤其为一种新型布鲁氏菌抗体检测方法，该检测方法是利用胶体金和乳胶微球桥连布病抗体，颗粒大小发生变化，然后通过分光光度计检测最大吸收、散射光波长变化来鉴定布病感染情况的一种技术。本发明专利技术通过胶体金和乳胶微球分别标记布鲁氏菌外膜蛋白，二者通过捕获布鲁氏菌病抗体形成“交连桥”，在凝集实验基础上，采用胶体金加乳胶微微球捕获布病抗体凝集原理，结合分光光度计法测试结果，大大提高了检测灵敏度，3～5分钟即可出结果，灵敏度高，判读客观，操作简单，便于基层人员检测使用。便于基层人员检测使用。便于基层人员检测使用。

【技术实现步骤摘要】
一种新型布鲁氏菌抗体检测方法


[0001]本专利技术涉及布鲁氏菌抗体检测
，具体为一种新型布鲁氏菌抗体检测方法。

技术介绍

[0002]布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌引起的人畜共患病，多发生于家畜中的羊、牛、猪中，引起高热、流产等症状，阳性病畜暴露人群具有高度感染风险。世界卫生组织OIE曾将其列为B类动物疫病，我国将该病列为二类动物疫病。
[0003]布鲁氏菌病常用的检测方法有虎红平板凝集试验、ELISA检测方法、细菌PCR检测方法等。而这些方法如ELISA方法、PCR检测方法存在对实验操作人员技术要求较高，检测周期长，试剂设备昂贵；虎红平板凝集试验检测灵敏度不高，特异性不强，肉眼判读，结果差异大等问题，不利于基层大量推广使用。

技术实现思路

[0004](一)解决的技术问题
[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种新型布鲁氏菌抗体检测方法，解决了ELISA方法、PCR检测方法存在对实验操作人员技术要求较高，检测周期长，试剂设备昂贵；虎红平板凝集试验检测灵敏度不高，特异性不强，肉眼判读，结果差异大等问题，不利于基层大量推广使用的问题。
[0006](二)技术方案。
[0007]本专利技术为了实现上述目的具体采用以下技术方案：
[0008]一种新型布鲁氏菌抗体检测方法，包括：分别包被有布鲁氏菌外膜蛋白OMP22、OMP25、OMP28的胶体金和乳胶微球、血清/血浆样本检测缓冲液、分光光度计。
[0009]进一步地，所述布鲁氏菌外膜蛋白OMP22、OMP25、OMP28通过原核表达，破碎、提取、纯化获得。
[0010]进一步地，所述胶体金为40nm大小的胶体金溶液。
[0011]进一步地，所述乳胶微球为外购含
‑
COOH，颗粒大小3μm的红色乳胶微球。
[0012]进一步地，所述血清/血浆样本检测缓冲液为10mMpH7.4的磷酸盐缓冲液。
[0013]进一步地，所述分光光度计要求波长在380～780nm之间有良好的精密度和准确。
[0014](三)有益效果
[0015]与现有技术相比，本专利技术提供了一种新型布鲁氏菌抗体检测方法，具备以下有益效果：
[0016]本专利技术，在凝集实验基础上，采用胶体金加乳胶微微球捕获布病抗体凝集原理，结合分光光度计法测试结果，大大提高了检测灵敏度，3～5分钟即可出结果，灵敏度高，判读客观，操作简单，便于基层人员检测使用。
附图说明
[0017]图1为本专利技术布鲁氏菌蛋白抗原标记胶体金颗粒通过布病阳性样本中的抗体与乳胶微球形成桥连结构示意图。
具体实施方式
[0018]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0019]实施例1
[0020]本专利技术一个实施例提出的一种新型布鲁氏菌抗体检测方法，布鲁氏菌外膜蛋白OMP22、OMP25、OMP28的制备方法包括以下步骤：
[0021](1)采用基因编辑手段，针对OMP22、OMP25、OMP28基因片段植入质粒中；
[0022](2)通过试管LB培养基筛选单克隆；
[0023](3)取至培养罐中扩大培养，37摄氏度培养3～5小时；
[0024](4)IPTG诱导，加入1毫升IPTG(预先配制的1Mol/L的IPTG，比例1：1000)，37℃下200转每分钟培养4小时；
[0025](5)离心收集菌体沉淀，超声破碎；
[0026](6)鉴别表达形式：凝胶电泳，取上清40ul；沉淀用100ul1
×
PBS重悬取40ul各加入10ul蛋白上样缓冲液(5
×
)沸水煮10min瞬离12％BT浓度的胶跑电泳；鉴别目的蛋白是在上清还是沉淀中；
[0027](7)HIS柱纯化，收集蛋白，测定浓度。
[0028]实施例2
[0029]本专利技术一个实施例提出的一种新型布病菌抗体检测技术，布病外膜蛋白标记胶体金和乳胶微球包括以下步骤：
[0030](1)40nm胶体金制备：采用柠檬酸三钠还原氯金酸制得；1％氯金酸0.5mL加入500mL去离子水中，加热至沸腾后，迅速加入0.6mL1％柠檬酸三钠，搅拌至溶液完全变红后继续加热搅拌2分钟，关火停止加热，等冷却后补加去离子水定容至500mL，测最大吸收波峰在525～527.5nm；
[0031](2)乳胶微球为购买商业化的带羧基红色乳胶微球，粒径3μm，固含4％，均一性CV＜5％，羧基含量180μmol/g；
[0032](3)胶体金标记OMP22、OMP25、OMP28中的1到2种；使用0.2MK2CO3溶液调节胶体金溶液pH，随后按配比为1mL：10μg将胶体金溶液与OMP蛋白混合进行标记，得到胶体金标记OMP工作液；
[0033](4)乳胶微球标记OMP22、OMP25、OMP28中的1到2种。使用NHS、EDC对乳胶微球进行活化，然后按20ug、40ug、60ugOMP蛋白：1mL0.1％乳胶微球溶液混合进行标记，得到乳胶微球标记OMP工作液。
[0034]实施例3
[0035]本专利技术一个实施例提出的一种新型布病菌抗体检测技术，血清/血浆缓冲液配制：
称取2.9g十二水合磷酸氢二钠、8.0g氯化钠、0.24g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾于1L玻璃烧杯中，加入800mL超纯水磁力搅拌至完全溶解后，定容至1L即可(pH调节至pH7.4)。
[0036]实施例4
[0037]本专利技术一个实施例提出的一种新型布病菌抗体检测技术，包括以下检测步骤：
[0038](1)如胶体金标记了布病蛋白OMP22、OMP25，则乳胶微球标记OMP28，这样尽可能的避开选择布病抗体相同的抗原蛋白位点，更好的形成桥连结构；
[0039](2)上述的标记的胶体金和乳胶微球体积比3:1体积混合制备工作液；
[0040](3)样本(血清/血浆)取20ul加入到2mL样本缓冲液中，再加入步骤(2)中胶体金和乳胶微球工作液30ul，混匀反应3分钟，即可用分光光度计测试结果。
[0041]胶体金本身具有较高的折射率，并可以产生极强的光散射，散射光强度与颗粒大小密切相关；胶体金和乳胶微球分别标记布鲁氏菌外膜蛋白，二者通过捕获布鲁氏菌病抗体形成“交连桥”；因乳胶微球粒径大，表面偶联的布病菌抗原表位多，一个乳胶微球可以交联5～10个胶体金颗粒，此种结合，使得桥连的胶体金颗粒急剧变大，通过分光光度计可明显检测到光吸收和散射最大值波长从520nm增加到620nm；该检测方法灵敏度高，判读客观，操作简单，可实用性强。
[0042]如图1所示，布鲁氏菌蛋白抗原标记胶体金颗粒通过布病阳性样本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型布鲁氏菌抗体检测方法，其特征在于：所述布鲁氏菌抗体检测方法所用的检测手段为分光光度计法检测，所述布鲁氏菌抗体检测方法采用表面标记有布鲁氏菌外膜蛋白的胶体金和乳胶微球，所述布鲁氏菌抗体检测方法采用的反应缓冲体系为磷酸盐缓冲体系。2.根据权利要求1所述一种新型布鲁氏菌抗体检测方法，其特征在于：所述胶体金颗粒大小为40nm，乳胶微球大小2～10μm，胶体金和乳胶微球上标记有布鲁氏菌外膜蛋白OMP22、OMP25...

【专利技术属性】
技术研发人员：游冬，张卓菁，梁如中，王逸，周丽，邹晓兰，李林，
申请(专利权)人：无锡中德伯尔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：