一种细胞核靶向碳点、制备及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种细胞核靶向碳点、制备及应用，以间苯二胺和盐酸氨基脲为原料，无水乙醇为溶剂，通过一步溶剂热法合成细胞核靶向碳点。本发明专利技术成功合成了一种新型的具有ROS稳定性的细胞核靶向荧光碳点，同时具有入胞时间快，光稳定性好，化学稳定性高等优点，可用于细胞核的成像以及细胞铁死亡过程中核酸结构的成像，这是首次碳点用于铁死亡过程中核酸结构的动态成像。的动态成像。的动态成像。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞核靶向碳点、制备及应用


[0001]本专利技术涉及荧光纳米材料制造领域，具体涉及一种细胞核靶向碳点、制备及应用。

技术介绍

[0002]细胞铁死亡是一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的细胞程序性死亡方式，其在生物化学特征方面主要表现为细胞内活性氧 (ROS) 和脂质过氧化物的异常增加，在细胞核层面上的形态学变化特征主要表现为细胞核保持结构完整性和缺乏染色质的凝集。目前绝大多数研究中都是通过透射电子显微镜（TEM）来表征，但TEM有一些缺点，如制样麻烦，操作复杂，价格昂贵，而且细胞已失去活性。而通过荧光纳米材料可以实时观察活细胞核酸结构在铁死亡过程中的动态变化。但到目前为止，没有任何碳点应用于活细胞铁死亡过程中核酸结构的动态成像，这可能是由于其活性氧（ROS）稳定性差导致的。
[0003]近来，碳点作为一种新的荧光纳米材料，具有原料易得，制备方便，细胞毒性低，生物相容性好等优势，在生物医学等研究领域展示出广泛的应用前景。关于碳点靶向细胞核的相关报道不多，且大多存在着入胞时间长，荧光量子产率低，光稳定性差，成像不够清晰等缺陷。并且由于细胞铁死亡过程中会伴随着大量的活性氧（ROS）产生，所以用于细胞铁死亡过程中的细胞核碳点还需具有很强的化学稳定性，不与ROS (H2O2、OH
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) 反应。因此，开发新型的核靶向碳点是迫切必要的。

技术实现思路

[0004]本专利技术提出了一种细胞核靶向碳点、制备及应用，本专利技术提供的荧光碳点能特异性靶向细胞核，并且具有入胞时间快，光稳定性好，化学稳定性高等优点。更重要的是，碳点对活性氧（ROS）有极高的稳定性，可用于细胞核的成像以及活细胞铁死亡过程中核酸结构的动态成像。这是首次碳点用于活细胞铁死亡过程中核酸结构的动态成像。
[0005]实现本专利技术的技术方案是：一种细胞核靶向碳点的制备方法，以间苯二胺和盐酸氨基脲为原料，无水乙醇为溶剂，通过一步溶剂热法合成细胞核靶向碳点。
[0006]间苯二胺溶于无水乙醇中浓度为52 mM，盐酸氨基脲溶于无水乙醇中浓度为81 mM，所述间苯二胺和盐酸氨基脲在无水乙醇中于180 ℃反应12 h制备得到。
[0007]其合成路线如下：。
[0008]所述细胞为HepG2细胞。
[0009]本专利技术是用于细胞核靶向的碳点。
[0010]优选地，所述的碳点在细胞核的成像试剂中的应用。
[0011]优选地，所述的碳点在细胞铁死亡过程中核酸结构的成像检测试剂中的应用。
[0012]上述应用具体包括：所述碳点对ROS的化学稳定性，具体步骤如下：（1）将碳点的储备液稀释在PBS缓冲中，使终浓度为10 μg/ mL，得到混合液A；PBS缓冲溶液的浓度为10 mM，pH范围为7.2
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7.4；（2）将各ROS(H2O2、OH
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)溶液分别加入到混合液A，得到一系列混合液；各ROS溶液的浓度为100 μM；（3）将步骤（2）中得到的混合液转移至荧光比色皿中，利用荧光分光光度计，激发波长为455 nm，测量荧光强度。
[0013]（4）将DNA溶液加入到混合液A，DNA溶液的浓度为100μg/mL，得到一系列混合液B；（5）将混合液B转移至荧光比色皿中，利用荧光分光光度计，测量荧光强度；（6）将各ROS溶液加入到混合液B，得到一系列混合液；（7）将步骤（6）中得到的混合液转移至荧光比色皿中，利用荧光分光光度计，测量荧光强度。
[0014]所述碳点用于细胞核的成像以及细胞铁死亡过程中核酸结构的成像，具体步骤如下：（1）把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育，通过共聚焦显微镜观察观察碳点进入活细胞的时间；（2）把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育25min后，使用458nm激光持续扫描30次，观察荧光强度的变化；（3）把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育25min，然后加入细胞核商染NucRed
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Live 647，通过共聚焦显微镜观察碳点在细胞中的分布情况；（4）将细胞分别用DNAse和RNAse消化后，把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育25min，通过共聚焦显微镜观察碳点在细胞中的分布情况；（5）将细胞用铁死亡诱导剂Erastin孵育后，把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育25min，通过共聚焦显微镜观察碳点在细胞中的分布情况。
[0015]本专利技术提供的荧光碳点能特异性靶向细胞核，并且具有入胞时间快，光稳定性好，化学稳定性高等优点，更重要的是，碳点对活性氧（ROS）有极高的稳定性，可用于细胞核的成像以及细胞铁死亡过程中核酸结构的成像。这是首次碳点用于铁死亡过程中核酸结构的成像。
[0016]本专利技术的有益效果是：本专利技术细胞核靶向碳点，(1)具有入胞时间快，光稳定性好，化学稳定性高，ROS稳定性等优点。（2）能够特异性靶向细胞核。（3）首次用于细胞铁死亡过程中核酸结构的成像。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0018]图1是在455nm激发下，碳点在不同金属离子和氨基酸溶液中的荧光强度变化图。
[0019]图2是在455nm激发下，分别加入各种ROS物质后碳点荧光强度的变化（a），以及碳点与DNA结合后再加入各种ROS物质时荧光强度的变化（b）。
[0020]图3是4μg/mL荧光碳点进入细胞的时间和荧光强度随时间变化的曲线图。
[0021]图4是4μg/mL荧光碳点与细胞共同孵育25min后，使用458nm激光持续扫描30次前后的成像图（b）以及荧光强度的变化（a）。
[0022]图5是4μg/ mL荧光碳点和两滴细胞核商染NucRed
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Live 647的共定位图：（a）碳点共聚焦成像的荧光场（激发波长是458nm，收集波段是480nm
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580nm）（b）商染共聚焦成像的荧光场（激发波长是638nm，收集波段是650nm
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720nm）（c）共聚焦成像的明场和荧光场的叠加图（d）共染散点图。
[0023]图6是细胞经过DNAse和RNAse消化后，4μg/ mL荧光碳点进入细胞的成像图。
[0024]图7是细胞用铁死亡诱导剂（Erastin）孵育后，4μg/ mL荧光碳点进入细胞的成像图。
具体实施方式
[0025]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0026]实施例1碳点的制备方法，具体步骤如下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞核靶向碳点的制备方法，其特征在于：以间苯二胺和盐酸氨基脲为原料，无水乙醇为溶剂，通过一步溶剂热法合成细胞核靶向碳点。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：间苯二胺溶于无水乙醇中浓度为52 mM，盐酸氨基脲溶于无水乙醇中浓度为81 mM。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：反应温度为180 ℃，反应12 h。4.权利要求1
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3任一项所述的制备方法制备的碳点。5.权利要求4所述的碳点在细胞核的成像试剂中的应用。6.权利要求4所述的碳点在细胞铁死亡过程中核酸结构的成像检测试剂中的应用。7.权利要求4所述的碳点在对ROS稳定性研究中的应用。8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，具体步骤如下：（1）把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育，通过共聚焦显微镜观察观察碳点进入活细胞的时间；（2）把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育25min后，使用458nm激光持续扫描30次，观察荧光强度的变化；（3）把4μg/ mL荧光碳点与细胞共同孵育25min，然后加入细胞核商染NucRed
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Live 647，通过共聚焦显微镜观察碳点在细胞中的分布情况；（4）将细胞分别用DNAse和RNAse消...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨冉，黄昌昇，孙远强，李朝辉，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：