一种抗衰祛皱的酵母提取物的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种抗衰祛皱的酵母提取物的制备方法及其应用。所述制备方法包括：制备用于生产酵母提取物的酿酒酵母，发酵培养得到发酵液；其中，所述用于生产酵母提取物的酿酒酵母通过肝素亲和试验、弹性蛋白酶活性抑制试验、人成纤维细胞活性实验或胶原蛋白生成试验中的任意一种或至少两种试验筛选得到；所述发酵液经过分子筛纯化和肝素亲和层析纯化，得到所述抗衰祛皱的酵母提取物。所述制备方法建立了一种高肝素亲和酵母选育的高通量筛选体系，同时以弹性蛋白酶抑制活性、人成纤维细胞增殖活性和胶原蛋白促进活性试验为评测基础，获得具有抗衰祛皱功效的酵母提取物，所述酵母提取物作为天然安全的添加物，具有重要的经济价值。值。值。

【技术实现步骤摘要】
一种抗衰祛皱的酵母提取物的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及日化产品制备
，具体涉及一种抗衰祛皱的酵母提取物的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]近年来，抗衰紧致、祛皱修复类化妆品市场发展十分迅速，相关产品已经成为美容护肤行业的主流产品之一；另外，消费者也不只单纯追求物理遮蔽类或化工合成类产品，而越来越多的去寻找具有高科技含量、天然温和、安全有效的生物技术类抗衰祛皱产品。
[0003]目前市面上具有明确抗衰紧致、祛皱修复功效的化妆品原料种类繁多，其中酵母提取物以及细胞生长因子多肽类原料有着其他化工原料不可比拟的优势。有资料显示，酵母提取物具有营养丰富、分子量小，易于吸收，功效全面等优点，能特异性地支持皮肤自身的保护和修复基质，具有延缓皮肤衰老、保湿、改善肤质、敏感修复、紧致祛皱等多种功效，能够为正常皮肤和问题皮肤提供预防护理，显著改善肌肤组织生理功能，促进机体新陈代谢、修复组织损伤，以及防止肌肤衰老提前发生。生长因子类生物多肽成分无药物毒性，免疫原性低，与生物组织的亲和性、相容性、相似性均较好，以及能与特异性的受体结合等特点，对调节皮肤细胞(角质细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等)生长、增殖，基质合成与组织分化，促进生物大分子(DNA、RNA和蛋白质)的合成，祛皱祛斑，修复创伤，以及抑制衰老基因的表达，延缓表皮细胞衰老起着重要作用。
[0004]但在实际应用过程中这两类化妆品原料均出现了一些问题：
[0005]1、酵母提取物功效全而不精，没有非常明确的抗衰祛皱侧重点，难以满足用户对化妆品需求的精准分类和定位；
[0006]2、酵母提取物成分复杂，大多生产厂家不能清晰明确的标示其具体成分及含量，并阐明其发挥功效的具体机制；
[0007]3、应用于化妆品领域的这两类原料质量标准较高，制备工艺复杂，成本高；
[0008]4、生长因子多肽类原料应用于护肤品中仍存在透皮吸收、过度增殖的争议；
[0009]5、生长因子EGF(Epidermal Growth Factor)已被明确排除在化妆品可使用的原料之外，含有生长因子EGF的护肤品难以获得生产销售的批准，也较难被消费者接受。
[0010]因此，研发一种类似生长因子结构和功能、具有显著抗衰祛皱功效的酵母提取物具有重要的实际应用价值。

技术实现思路

[0011]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种抗衰祛皱的酵母提取物的制备方法及其应用。本专利技术所建立的用于高肝素(Heparin)亲和酵母选育的高通量筛选体系，同时构建在弹性蛋白酶抑制活性、人成纤维细胞增殖活性和胶原蛋白促进活性试验评测基础上，为酵母提取物生产提供了一种新的制备方法，所得酵母提取物功效明确，机制清晰，具有较高的应用价值。
[0012]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0013]第一方面，本专利技术提供一种抗衰祛皱的酵母提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0014](1)制备用于生产酵母提取物的酿酒酵母，发酵培养得到发酵液；
[0015]其中，所述用于生产酵母提取物的酿酒酵母通过肝素亲和试验、弹性蛋白酶活性抑制试验、人成纤维细胞活性实验或胶原蛋白生成试验中的任意一种或至少两种试验筛选得到；
[0016](2)所述发酵液经过分子筛纯化和肝素亲和层析纯化，得到所述抗衰祛皱的酵母提取物。
[0017]本专利技术中，鉴于具有显著抗衰祛皱功效的生长因子多肽类活性物质，在一级结构上有30％左右的同源性及非常类似的结构域和空间构象，且均对肝素有较高的亲和力，因此，本专利技术利用肝素亲和筛选、弹性蛋白酶活性抑制试验、人成纤维细胞增殖试验和胶原蛋白生成试验高通量筛选工业酿酒酵母的类因子结构多功能多肽库，高效获得高肝素亲和且能制备具有抗衰祛皱功效的酵母提取物的酵母菌株，并通过优化提取工艺以及改良应用配方等，尽可能减少纯化提取过程的繁杂步骤降低成本，提高酵母提取物的抗衰祛皱效果，以解决生长因子多肽类活性物质化妆品原料在实际生产应用中出现的弊端。
[0018]作为本专利技术优选的技术方案，步骤(1)所述肝素亲和试验的操作包括：
[0019]先用平衡液平衡3～4V柱床，上样，冲洗杂蛋白；而后，以洗脱液洗脱所述柱床上的蛋白，收集所述蛋白并得到所述蛋白的总量，依据蛋白总量筛选所述酿酒酵母。
[0020]优选地，步骤(1)所述弹性蛋白酶活性抑制试验的操作包括：
[0021]将弹性蛋白底物和酿酒酵母的发酵液上清混合，再加入弹性蛋白酶，孵育后检测，得到所述弹性蛋白酶的活性和所述酿酒酵母的弹性蛋白酶活性抑制率。
[0022]优选地，步骤(1)所述人成纤维细胞活性实验采用MTT法进行。
[0023]优选地，步骤(1)所述胶原蛋白生成试验采用酶联免疫Elisa试剂盒进行。
[0024]本专利技术中，所述酿酒酵母可以通过如下方法筛选得到：
[0025]1、肝素亲和试验初筛菌种：
[0026]a)用移液枪吸取适量收集得到的不同酵母菌悬液涂布于无抗性YPD平板上，30℃培养72h；挑取菌落直径大、生长优势的菌株，置于无抗性的YPD液体培养基中，30℃培养48h，做好菌株标号标记和菌种保种保藏工作，其余菌液离心后进行超声破碎，离心后上清进行肝素亲和纯化初筛；
[0027]b)酵母菌体处理的方法及条件为：用重悬液(20mM Tris
‑
HCl，0.1M NaCl，pH 7.0)将菌体按菌体湿重(g)：重悬液(mL)＝1:15混合，10000rpm重悬3min，组织捣碎匀浆机高压800bar两次匀浆；接着，将探头插入匀浆中，距离容器底约3cm，设定功率10％，每次超声3s，间隔时间5s，超声时间20min，超声次数3次，此过程在冰浴中进行；菌体破碎后使用大型低温离心机4℃，17000g离心30min，收集上清液；然后使用0.45μm滤膜过滤上清液后上样初筛；
[0028]c)肝素亲和纯化初筛的方法及条件为：
[0029]先用0.6mol NaCl
‑
20mM PB缓冲液(温度：15～19℃，pH值：6.4～6.6，电导：40～50ms/cm)以不高于80cm/h(体积流速419mL/min)线性流速平衡约3～4V柱床(不低于3V床)；
[0030]过滤后的菌体上清液按蛋白含量(mg):柱床体积V(mL)＝(1～2):1的量进行上样，
接着用PB缓冲液以不高于80cm/h的线性流速冲洗杂蛋白至紫外示数接近基线，电导率、pH值等参数基本不变(洗脱体积在3～4V柱床)；
[0031]用1.2～1.5mol NaCL
‑
20mmPB洗脱液(温度：15～19℃，pH值：6.2～6.3电导：75～95ms/cm)，以不高于80cm/h的线性流速进行洗脱洗脱至紫外示数接近基线(洗脱体积在3～4V柱床)，为获得较好的纯度，可以分梯度进行洗脱；
[0032]按照收集液收集量(体积
×...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗衰祛皱的酵母提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(1)制备用于生产酵母提取物的酿酒酵母，发酵培养得到发酵液；其中，所述用于生产酵母提取物的酿酒酵母通过肝素亲和试验、弹性蛋白酶活性抑制试验、人成纤维细胞活性实验或胶原蛋白生成试验中的任意一种或至少两种试验筛选得到；(2)所述发酵液经过分子筛纯化和肝素亲和层析纯化，得到所述抗衰祛皱的酵母提取物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述肝素亲和试验的操作包括：先用平衡液平衡3～4V柱床，上样，冲洗杂蛋白；而后，以洗脱液洗脱所述柱床上的蛋白，收集所述蛋白并得到所述蛋白的总量，依据蛋白总量筛选所述酿酒酵母；优选地，步骤(1)所述弹性蛋白酶活性抑制试验的操作包括：将弹性蛋白底物和酿酒酵母的发酵液上清混合，再加入弹性蛋白酶，孵育后检测，得到所述弹性蛋白酶的活性和所述酿酒酵母的弹性蛋白酶活性抑制率；优选地，步骤(1)所述人成纤维细胞活性实验采用MTT法进行；优选地，步骤(1)所述胶原蛋白生成试验采用酶联免疫Elisa试剂盒进行。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述用于生产酵母提取物的酿酒酵母的制备方法包括：先将工业酿酒酵母菌种活化、发酵培养，再采用ARTP系统进行微生物育种；所述育种完成后，使用肝素亲和试验对所得菌株进行初筛；而后，采用弹性蛋白酶活性抑制试验、人成纤维细胞活性实验或胶原蛋白生成试验中的任意一种或至少两种对初筛后得到的菌株进行复筛，得到所述用于生产酵母提取物的酿酒酵母；优选地，所述ARTP系统进行微生物育种的处理条件为：氦气流速5～35L/min、输入功率100～120W、照射距离1～3mm、处理温度低于40℃、时间30～180s。4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述分子筛纯化采用的分子筛包括Superdex
TM
30prep grade；优选地，所述分子筛纯化采用的冲洗液包括PB缓冲液；优选地，所述冲洗液的温度为15～19℃；优选地，所述冲洗液的pH值为6.5～7.2；优选地，所述冲洗液的电导为1800μs/cm～2ms/cm。5.根据权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述肝素亲和层析...

【专利技术属性】
技术研发人员：于忠国，赵振岭，刘琳，孙大鹏，刘广玉，陈慧敏，
申请(专利权)人：广州暨创生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：