一种黄颡鱼醛还原酶蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种黄颡鱼醛还原酶重组蛋白及其制备方法和应用，属于基因工程技术领域，其中所述黄颡鱼醛还原酶蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示。本发明专利技术通过从黄颡鱼中克隆AKR1A1基因并进行体外表达和分离纯化，获得黄颡鱼醛还原酶重组蛋白，为研究黄颡鱼醛还原酶的性质和功能奠定基础；同时本发明专利技术还分析了黄颡鱼醛还原酶AKR1A1在重金属镉诱导的氧化应激中的调控作用和对免疫相关基因表达的影响，首次验证了所述黄颡鱼醛还原酶AKR1A1在抵抗重金属镉引起的组织损伤中的作用，研究发现经腹腔注射所述黄颡鱼醛还原酶AKR1A1后，可显著提高黄颡鱼在重金属镉诱导的氧化应激条件下肝脏组织的抗氧化能力，减少氧化损伤。减少氧化损伤。减少氧化损伤。

【技术实现步骤摘要】
一种黄颡鱼醛还原酶蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种黄颡鱼醛还原酶蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]醛酮还原酶(AKR)是一类分子量为37kDa的单体蛋白，具有NAD(P)H依赖活性。AKR1A1是AKR超家族成员之一，也被称为醛还原酶，具有广泛的底物谱，是机体潜在的羰基解毒酶。HNE是脂质过氧化产生的最具生物活性的醛类抗氧化剂，可通过与谷胱甘肽S转移酶(GSTs)或谷胱甘肽(GSH)结合形成复合物GSH
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HNE，而AKR1A1是参与HNE和GSH
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HNE还原反应的重要氧化还原酶。目前关于AKR1A1功能方面的研究主要集中在哺乳动物上，鱼类中该基因的相关报道很少。在哺乳动物中，AKR1A1被证实是一种新型的哺乳动物S
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亚硝基谷胱甘肽还原酶，可以促进维生素C的生物合成，同时也是人体肝脏主要的阿霉素还原酶。在鱼类中，AKR1A1在维持斑马鱼生理血糖浓度，缓解葡萄糖诱导器官损伤方面起重要作用；罗非鱼AKR1A1可被苯并芘诱导表达。
[0003]镉污染是水体污染中比较常见的一种，鱼类受急性镉污染影响会导致严重的器官氧化损伤和炎症反应，并且受镉污染的鱼类还会随着食物链进入人体，影响人体健康。
[0004]黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)是鲿科，属一种常见小型淡水经济鱼类，在我国各大水系都有分布，其氨基酸含量丰富，肉质细嫩，味道鲜美，营养价值高，无肌间刺，具有滋补作用和药用价值，迅速得到人们的普遍认可，具有广泛的经济价值。目前关于黄颡鱼的醛还原酶的相关功能，及其在镉胁迫中的潜在作用尚不清楚，有待进一步探索研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术的空白，提供了一种黄颡鱼醛还原酶蛋白及其制备方法和应用，通过从黄颡鱼中克隆AKR1A1基因并进行体外表达和分离纯化，获得黄颡鱼醛还原酶重组蛋白；进一步分析了该重组蛋白在重金属镉诱导的氧化应激中的调控作用和对免疫相关基因表达的影响，为进一步探索鱼类AKR1A1基因的功能具有重要意义。
[0006]本专利技术的目的之一在于提供一种黄颡鱼醛还原酶蛋白，所述黄颡鱼醛还原酶蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术的目的之二在于提供编码所述黄颡鱼醛还原酶蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术的目的之三在于提供一种载体，所述载体包含上述编码黄颡鱼醛还原酶蛋白的基因。
[0009]本专利技术的目的之四在于提供一种细胞，所述细胞中包含上述载体。
[0010]本专利技术的目的之五在于提供了所述黄颡鱼醛还原酶蛋白的制备方法，包括：提取黄颡鱼肝脏组织总RNA，经反转录后采用如SEQ ID NO.3
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4所示的引物进行PCR扩增，扩增产物与表达载体连接并转化至受体细胞中，然后诱导所述受体细胞表达并纯化，得到所述黄
颡鱼醛还原酶蛋白。
[0011]进一步地，所述方法具体包括：
[0012]步骤1、提取黄颡鱼肝脏组织总RNA，利用M
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MLV反转录酶合成cDNA，采用SEQ ID NO.3
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4所示的引物进行PCR扩增，扩增产物经回收、纯化后得到黄颡鱼醛还原酶蛋白的编码基因片段；
[0013]步骤2、将步骤1的基因片段与载体pET
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28a(+)同时进行EcoRI和Hind III双酶切，经回收、纯化、连接后，构建得到原核表达载体pET
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AKR1A1；
[0014]步骤3、将所述原核表达载体pET
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AKR1A1转化至E.coli BL21(DE3)受体细胞中，涂布于含卡那霉素平板上进行抗性筛选，并经菌落PCR验证及SDS
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PAGE电泳检测获得阳性表达菌株；
[0015]步骤4、将上述阳性表达菌株接种至含有卡那霉素的培养基中培养，用IPTG进行诱导表达；
[0016]步骤5、诱导表达后的菌液离心收集菌体，菌体经超声破碎后离心收集沉淀，将沉淀用平衡缓冲液溶解，收集上清，加至Ni离子亲和柱中，结合后洗脱，获得纯化的黄颡鱼醛还原酶重组蛋白。
[0017]本专利技术的目的之六在于提供了所述黄颡鱼醛还原酶蛋白，或所述载体，或所述细胞在还原醛类和/或酮类物质中的应用。
[0018]进一步地，所述醛类物质选自：苯甲醛、邻苯二甲醛、甲醛、甲酸、戊二醛、甘油醛、丙酮醛；所述酮类物质选自：2,3
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丁二酮、2,3
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戊二酮。
[0019]本专利技术的目的之七在于提供了所述黄颡鱼醛还原酶蛋白，或所述载体，或所述细胞在制备预防或治疗重金属镉引起的组织损伤药物中的应用。
[0020]进一步地，所述黄颡鱼醛还原酶蛋白具有抑制IL
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1β和细胞凋亡因子capase3a的表达，促进细胞因子IL
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10表达，提高过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，以及提高抗氧化能力的作用。
[0021]进一步地，所述黄颡鱼醛还原酶蛋白的注射量为1～100μg。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0023](1)本专利技术利用基因工程技术，构建了黄颡鱼醛还原酶AKR1A1基因的原核表达载体，通过诱导表达并纯化获得了其重组蛋白，为进一步研究黄颡鱼醛还原酶的性质和功能奠定基础；
[0024](2)本专利技术验证了所述黄颡鱼醛还原酶AKR1A1重组蛋白对醛类和酮类物质的还原作用并分析了其底物谱，对该酶的工业化应用具有理论指导意义和参考价值；
[0025](3)本专利技术首次验证了所述黄颡鱼醛还原酶AKR1A1在抵抗重金属镉引起的组织损伤中的作用，研究发现经腹腔注射所述黄颡鱼醛还原酶AKR1A1后，可显著提高黄颡鱼在重金属镉诱导的氧化应激条件下肝脏组织的抗氧化能力，减少氧化损伤。
附图说明
[0026]图1为本专利技术实施例1中黄颡鱼醛还原酶基因AKR1A1基因表达、纯化后的SDS
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PAGE电泳图，其中泳道1：空白质粒菌株；泳道2：诱导前的含pET
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28
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AKR1A1菌株；泳道3：诱导后的含pET
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28
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AKR1A1菌株；泳道4：纯化后的AKR1A1蛋白；M：Marker；
[0027]图2为本专利技术实施例3中腹腔注射不同剂量AKR1A1重组蛋白对镉胁迫下肝脏炎症因子IL
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1β基因表达的影响；
[0028]图3为本专利技术实施例3中腹腔注射不同剂量AKR1A1重组蛋白对镉胁迫下肝脏凋亡因子caspase3a基因表达的影响；
[0029]图4为本专利技术实施例3中腹腔注射不同剂量AKR1A1重组蛋白对镉胁迫下肝脏抗炎因子IL
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10基因表达本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黄颡鱼醛还原酶蛋白，其特征在于，所述黄颡鱼醛还原酶蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。2.一种编码权利要求1所述的黄颡鱼醛还原酶蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。3.一种载体，其特征在于，所述载体中包含如权利要求2所述的基因。4.一种细胞，其特征在于，所述细胞中包含如权利要求3所述的载体。5.如权利要求1所述的黄颡鱼醛还原酶蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：提取黄颡鱼肝脏组织总RNA，经反转录后采用如SEQ ID NO.3
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4所示的引物进行PCR扩增，扩增产物与表达载体连接并转化至受体细胞中，然后诱导所述受体细胞表达并纯化，得到所述黄颡鱼醛还原酶蛋白。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括：步骤1、提取黄颡鱼肝脏组织总RNA，利用M
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MLV反转录酶合成cDNA，采用SEQ ID NO.3
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4所示的引物进行PCR扩增，扩增产物经回收、纯化后得到黄颡鱼醛还原酶蛋白的编码基因片段；步骤2、将步骤1的基因片段与载体pET
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28a(+)同时进行EcoRI和Hind III双酶切，经回收、纯化、连接后，构建得到原核表达载体pET
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AKR1A1；步骤3、将所述原核表达载体pET
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【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，孙文秀，杨龙，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：