circ_0000173作为卵巢癌预后、治疗标志物的应用制造技术

环状RNA circRNA_0000173在卵巢癌组织中表达上调；其高表达可预测预后不良；抑制circRNA_0000173表达能够抑制了卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮

【技术实现步骤摘要】
circ_0000173作为卵巢癌预后、治疗标志物的应用


[0001]本专利技术涉及分子检测
,尤其涉及circRNA检测和治疗卵巢癌的方法。

技术介绍

[0002]卵巢癌为女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，近年来其发病率趋于稳定，但死亡率仍呈上升趋势，是妇科恶性肿瘤死亡的主要原因，居女性肿瘤相关死亡原因的第五位。卵巢癌发病隐匿，早期通常无明显症状，且缺乏有效的筛查和早期诊断措施，待确诊时70％的患者已处于晚期。就世界范围而言，女性一生中发生卵巢癌的风险比为1.4～1.5％，而卵巢癌的死亡风险比约为1％。针对卵巢癌组织异质性以及高通量测序的研究表明，卵巢肿瘤中大多为上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer,EOC)。虽然进行肿瘤细胞减灭术的基础上辅以铂类和紫杉醇为主的化疗，以及近年来免疫疗法和腹腔热灌注化疗等新疗法的尝试，但其临床缓解的平均时间为两年，五年生存率仅在30％左右。卵巢癌高死亡率的原因主要包括早期筛检指标较少、早期诊断困难，同时伴随高转移和复发，此外，卵巢癌在手术治疗过程中难以完全清除病灶，致使术后复发率高、预后差。因此，探究新的卵巢癌发病机制、寻找潜在的诊治靶标和肿瘤标志物，是目前卵巢癌基础和临床研究领域亟待解决的重点和难点。
[0003]近年来，表观遗传学在卵巢癌领域的研究进展十分迅速。表观遗传能从染色质、DNA、蛋白质和RNA水平调节基因的表达，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、核小体重构和非编码RNA调节等
[7]，其中RNA在表观遗传调控过程中起着关键作用，不仅可以作为从DNA到蛋白质的信息传递中间体，且其本身也具有各种生物学功能。环状RNA(Circular RNA,circRNA )是近年来备受关注的一种具有闭合环状结构的一种新型非编码RNA，其表达水平高、稳定且分布广泛。circRNA根据其组成和循环机制的不同主要分为3个类别：外显子circRNA、内含子circRNA和外显子
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内含子circRNA。
[0004]circRNA由前体mRNA(pre
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mRNA)产生，并由RNA聚合酶II转录，该结构使得circRNA缺乏5
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多聚A尾，此特征使得成熟的circRNA结构稳定、序列保守、高度丰富，并在特殊条件下动态表达在特定组织内部。因此circRNA可以抵抗核酸外切酶的降解，而circRNA表达丰富，在各个物种间较为保守，且其表达具有组织及发育时序的特异性。circRNA因具备以下分子标志物特点：选择性高表达，常与线性RNA(hostgene)的表达量相当，在增生慢的细胞及器官中表达量高；高度稳定，闭合环状的结构可抵抗RNase的降解；在不同的物种间相对保守；特异性表达，circRNA的表达具有组织及发育时序的特异性；便于检测，不仅肿瘤组织中表达，还可以通过血清、尿液检测。目前的研究已证实功能性circRNA可以以多种方式影响肿瘤的发生发展，如内源性竞争抑制microRNA、与circRNA结合蛋白相互作用、调节转录或剪接。在妇科恶性肿瘤领域，已有数篇关于circRNA靶向蛋白质分子或circRNA
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miRNA—mRNA网络在女性生殖系统肿瘤发生发展作用中的报道，如circRNA_0049116(circMUC16)在卵巢癌中通过结合ATG13蛋白，上调ATG13在卵巢癌细胞中的表达，增强其自噬，从而促进卵巢癌细胞的增殖和转移
[22]，而circRNA_0132980(circSLC26A4)可通过竞争结合miR
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5p，上调HOXA7，进而促进宫颈癌的进展。上述研究提示circRNA在女性生殖系统肿瘤研究中的巨大潜力。尽管如此，人们对circRNA的产生及生物学功能认识还非常有限，关于circRNA对妇科常见恶性肿瘤尤其是恶性度和病死率极高的卵巢癌的发生、发展中的作用及相关机制不甚了解。
[0005]已知PKM2既是催化糖酵解的限速酶，又是调控肿瘤有氧糖酵解的关键酶。肿瘤细胞高表达低催化活性的PKM2赋予了肿瘤细胞特异的糖代谢的表型，为肿瘤细胞提供了大量的ATP、合成核酸的中间体、氨基酸及脂类。在肿瘤细胞中，PKM2取代了其他丙酮酸激酶正常表型(PKMl、PKL和PKR)，导致葡萄糖摄取提高，糖代谢物累积和代谢重编程(从糖有氧氧化为主变成糖无氧氧化为主)，为癌细胞的生长和存活提供了有利且必要的条件。肿瘤细胞的快速增殖和侵袭中会出现营养物质相对缺乏的条件，肿瘤细胞以特殊的方式获取和利用各种营养物质，除了需要糖、脂类，还包括乳酸、酮体、乙酸、支链氨基酸等非传统的代谢原料的摄取与利用。PKM2除了促进肿瘤细胞有氧糖酵解这一代谢途径外，也可通过非代谢调控途径发挥促肿瘤作用，它的作用近年倍受肿瘤领域研究的关注。
[0006]截止到目前，并未有现有技术提示了具体的circRNA与PKM2的关系以及二者是否能够用于具体的肿瘤诊断和预后的相关研究，本专利技术要解决的技术问题是通过研究发现具体的circRNA及其与PKM2的关系，并将其应用于具体肿瘤的诊断。

技术实现思路

[0007]在本专利技术中,我们发现并鉴定了一个新环状RNA circRNA_0000173,通过NCBI
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SRA数据库分析，1)与对照正常组织相比，在卵巢癌组织中表达上调；2)同时,circRNA_0000173的高表达可预测预后不良；3)从功能上分析,circRNA_0000173表达降低能够抑制了卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮
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间充质转化；4)重要的是,circRNA_0000173可通靶向性结合PKM2蛋白，在细胞实验中,我们证实circRNA_0000173通过结合PKM2蛋白在肿瘤发生和转移中发挥了促进作用。综上所述,我们的专利技术可以提供一个新的诊断生物标志物和一个强有力的卵巢癌治疗靶点。
[0008]本专利技术为进一步验证circ_0000173作为环状RNA的确定性，通过使用Northern blot并且切胶进行Sanger测序，证实了其碱基序列为反向成环；而针对RNA扩增产物的凝胶电泳中，我们发现mRNA经circ_0000173引物扩增相应的特异条带，而在基因组DNA中未发现该条带。荧光原位杂交(FISH)定位分析表明，circ_0000173在卵巢癌细胞的细胞浆与细胞核中存在广泛表达)。
[0009]此外，本专利技术探究了circRNA_0000173对卵巢癌细胞进展的情况。以circRNA_0000173高表达的A2780细胞系构建circRNA_0000173敲降模型，对circRNA_0000173低表达的SKOV3细胞系构建circRNA_0000173过表达模型。我们通过Edu细胞增殖法检测卵巢癌细胞的增殖水平，结果发现，敲降circRNA_0000173可抑制细胞增殖，而上调circRNA_0000173则促进增殖。克隆形成实验结果表明，敲降circRNA_0000173抑制细胞集落形本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.环状RNA circRNA_0000173在制备诊断卵巢癌试剂中的应用。2.权利要求1所述的应用，其中circRNA_0000173的序列如SEQ ID NO:1所示。3.特异性检测环状RNA circRNA_0000173的试剂在制备诊断卵巢癌中的应用。4.权利要求3所述的应用，其中所述的特异性检测环状RNA circRNA_0000173的试剂为核酸扩增引物、原位杂交探针；优选的，所述的特异性检测试剂为PCR扩增引物，其序列为SEQ ID NO:2
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3所示；所述的原位杂交探针序列如SEQ ID NO:4所示。5.环状RNA circRNA_0000173在制备预后卵巢癌试剂中的应用，优选的，其中circRNA_0000173的序列如SEQ ID NO:1所示。...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏大静，汪舫，吴一华，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：