苹果黄蚜Cat-B基因及其核酸干扰剂制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种苹果黄蚜Cat

【技术实现步骤摘要】
苹果黄蚜Cat
‑
B基因及其核酸干扰剂制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种苹果黄蚜Cat
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B(Cathepsin
‑
B)基因及其应用、核酸干扰剂及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]苹果黄蚜是我国苹果产区危害严重的叶面害虫，其在刺吸危害的同时还可传播植物病毒病，诱发果树发生多种病害，其排出的蜜露覆盖于叶面及果实，诱发叶片霉污病，严重影响叶片的光合作用和果品质量。目前，使用化学农药仍是控制苹果黄蚜的主要方法，但高强度的农药选择压力逐渐加剧了其抗药性的发展、“3R”问题日益突出，果品农残超标率居高不下，不仅影响果品出口，增加害虫治理成本和难度，还严重影响生态安全。因此，开发对环境友好的可持续的苹果黄蚜治理策略已成当务之急。开发基于RNAi的苹果黄蚜绿色防控新技术是解决上述问题的新策略。
[0003]RNA干扰(RNAi)是一种转录后基因沉默现象，是指内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA在细胞内特异降解该mRNA，从而使相应基因沉默，达到阻止基因表达的目的，现已被国际上公认为“第四代杀虫剂”核心技术。目前对昆虫进行RNAi主要是通过注射和饲喂dsRNA的方式，但是这两种方式很难应用到生产实践中，由于昆虫体壁的阻挡，单独喷洒dsRNA分子对害虫无效，因此，开发可喷洒使用的具有触杀作用的dsRNA制剂尤为重要。根据苹果黄蚜致死基因及基因沉默技术原理，开发可喷洒使用的基因干扰制剂，对苹果黄蚜进行高效、绿色、精准防控。该技术对防治苹果黄蚜具有特异性，对天敌及其他哺乳动物无害，不污染环境，大幅降低果园化学农药的使用，保障果品品质及食品安全。

技术实现思路

[0004]为解决现有技术的缺点和不足，本专利技术要解决的技术问题是苹果克服现有RNAi害虫防治技术的不足，提供一种苹果黄蚜致死基因及其应用、核酸干扰剂及核酸干扰剂的制备方法和应用，苹果黄蚜致死基因与组织蛋白酶B的活性有关，根据致死基因设计dsRNA可以抑制组织蛋白酶B的活性，使得苹果黄蚜蛋白质代谢受阻，最终导致苹果黄蚜死亡。将合成的dsRNA与昆虫体壁渗透剂快速渗透剂T、氮酮、NP
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10混配，将其制备成可喷洒使用的核酸干扰剂，可以对苹果黄蚜进行高效精准防治，具有杀虫特异性强、环境友好、防效高等优势。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了一种苹果黄蚜Cat
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B(Cathepsin B)基因，所述Cathepsin
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B基因为苹果黄蚜致死基因，所述Cathepsin
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B基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。通过提取苹果黄蚜的总RNA，反转录合成cDNA第一条链，以第一条链为模板，设计上下游引物对Cathepsin
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B的cDNA片段进行PCR扩增。
[0006]进一步的，所述上游引物DNA序列为：ATTTCATTCGTGATTTTCGTTTC；下游引物DNA序列为：CATTGGCGTTCTACGGAGACTCG。
[0007]基于一个总的构思，本专利技术还提供了一种苹果黄蚜Cathepsin
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B基因的应用。
[0008]基于一个总的构思，本专利技术还提供了一种核酸干扰剂，所述核酸干扰剂的主效成分为dsCathepsin
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B，所述dsCathepsin
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B为权利要求1所述的Cathepsin
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B基因的cDNA片段合成的特异性dsRNA，所述dsCathepsin
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B的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]基于一个总的构思，本专利技术还提供了一种核酸干扰剂的制备方法，包括以下步骤：
[0010]步骤1：根据Cathepsin
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B基因的cDNA序列合成特异性引物，以苹果黄蚜整虫cDNA为模板，进行PCR扩增获得扩增产物，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到纯化的目的DNA片段；
[0011]步骤2：将目的DNA片段合成为目的dsRNA，获得核酸干扰剂的主效成分；
[0012]步骤3：将获得的dsRNA与渗透剂进行混配，得到可喷洒使用的核酸干扰剂。
[0013]进一步的，所述步骤1中的特异性引物包括上游引物以及下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示。
[0014]进一步的，所述步骤1中的PCR扩增反应体系为：25μL 2
×
Taq PCR Master Mix，2μL cDNA模板，2μL上游引物，2μL下游引物，19μL ddH2O。
[0015]PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min，然后进入下述循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35次循环；最后在72℃下延伸10min。
[0016]进一步的，所述步骤2具体为：采用Promega dsRNA合成试剂盒将所述DNA片段进行合成，得到核酸干扰剂主效成分dsRNA；
[0017]dsRNA合成反应体系为：8μL dNTP(100mM)，1μg DNA，2μL 10
×
Reaction Buffer，2μL T7 RNA Polymerase Mix，加ddH2O补足到总体积为20μL；
[0018]dsRNA合成PCR反应条件为：37℃，4h；70℃，10min；25℃，20min。
[0019]进一步的，所述步骤3中可喷洒使用的核酸干扰剂配方为：在主效dsRNA水溶液中加入2％(v/v)的快速渗透剂T、1％(v/v)的氮酮、0.5％(v/v)的NP
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10。
[0020]基于一个总的构思，本专利技术还提供了一种核酸干扰剂在防治苹果黄蚜中的应用。
[0021]进一步的，一种核酸干扰剂在防治苹果黄蚜中的应用，包括以下步骤：
[0022]步骤1：将核酸干扰剂加水配制成0.75μg/μL的溶液；
[0023]步骤2：采用喷雾的方式将上述核酸干扰剂溶液喷洒在苹果黄蚜体表。
[0024]本专利技术的有益效果是：
[0025]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：
[0026](1)本专利技术提供一种苹果黄蚜Cat
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B(Cathepsin
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B)基因，所述Cathepsin
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B基因为苹果黄蚜致死基因，Cathepsin
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B基因编码组织蛋白酶B，是苹果黄蚜蛋白质代谢中的关键酶。本专利技术根据苹果黄蚜Cathepsin
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B基因进行设计，开发能够抑制Cathepsin
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B基因表达的生物制剂，从而阻碍苹果黄蚜的蛋白质代谢能力，并导致苹果黄蚜死亡。这种生物制剂是特意针对苹果黄蚜Cathepsin...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种苹果黄蚜Cat
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B基因，其特征在于：所述Cat
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B基因为苹果黄蚜致死基因，所述Cat
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B基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种权利要求1所述的苹果黄蚜Cat
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B基因在防治苹果黄蚜中的应用。3.一种核酸干扰剂，其特征在于：所述核酸干扰剂的主效成分为dsCat
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B，所述dsCat
‑
B为权利要求1所述的Cat
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B基因的cDNA片段合成的特异性dsRNA，所述dsCat
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B的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。4.一种权利要求3所述的一种核酸干扰剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：根据Cat
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B基因的cDNA序列合成特异性引物，以苹果黄蚜整虫cDNA为模板，进行PCR扩增获得扩增产物，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到纯化的目的DNA片段；步骤2：将目的DNA片段合成为目的dsRNA，获得核酸干扰剂的主效成分；步骤3：将获得的dsRNA与渗透剂进行混配，得到可喷洒使用的核酸干扰剂。5.根据权利要求4所述的一种核酸干扰剂的制备方法，其特征在于：所述步骤1中的特异性引物包括上游引物以及下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的序列如SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩鹏飞，范继巧，张建珍，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：