一种原位响应ROS的人工酶及其制备方法与应用技术

技术编号:30534156 阅读:18 留言:0更新日期:2021-10-30 13:08
本发明专利技术公开了一种原位响应ROS的人工酶及其制备方法与应用。本发明专利技术所提供的人工酶的结构式如式I所示。本发明专利技术通过四(3

【技术实现步骤摘要】
一种原位响应ROS的人工酶及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种原位响应ROS的人工酶及其制备方法与应用,属于人工酶和选择性诊断领域。

技术介绍

[0002]天然酶因其催化效率高在工业和日常生活中据有很高的利用价值,然而天然酶大多是由蛋白质或者RNA构成,其只能在特定的环境下有较高的催化活性。由于酸化或加热引起的蛋白质变性,会造成酶的不可逆失活。此外天然酶分离困难,导致其难以得到纯品且价格昂贵,这些因素限制其发展,因此迫切需要发展出具有较强催化活性和耐受性的人工酶。将天然酶的刺激响应行为整合到人工酶中可能使酶反应活性的调控成为可能,但这是具有挑战性的,因为它需要将刺激响应与催化部分的结合和精确定位相结合。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种人工酶(式Ⅰ所示化合物,简称PTT

SGH)及其制备方法与应用,PTT

SGH可响应细胞内源性ROS形成交联结构,原位提高催化酯水解活性,从而通过高对比度荧光选择性诊断肿瘤细胞。
[0004]本专利技术首先提供式Ⅱ所示化合物(即式Ⅰ所示化合物的前体,(3

Mal)

SGH)),
[0005][0006]本专利技术提供的人工酶(PTT

SGH),其结构式如式Ⅰ所示:
[0007][0008]本专利技术进一步提供了式Ⅰ所示化合物的制备方法,包括如下步骤:
[0009]式Ⅱ所示化合物与四(3

巯基丙酸)季戊四醇酯(PTT)进行迈克尔加成反应即得。
[0010]上述的制备方法中,所述迈克尔加成反应在无氧的条件下进行;
[0011]所述迈克尔加成反应的温度为23~27℃,时间为12~24h。
[0012]上述的制备方法中,所述迈克尔加成反应的溶剂为超干的DMSO或DMF;
[0013]所述迈克尔加成反应可采用催化量的正丙胺和TCEP进行催化(如式Ⅱ所示化合物的1%摩尔量的正丙胺、10%摩尔量的TCEP)。
[0014]式Ⅱ所示化合物与所述四(3

巯基丙酸)季戊四醇酯的摩尔比为1:2。
[0015]本专利技术提供的式Ⅰ所示化合物作为人工酶能够用于正常细胞和肿瘤细胞的成像,通过高对比度荧光实现肿瘤细胞的诊断;
[0016]所述正常细胞为人肺成纤维细胞HPF;
[0017]所述肿瘤细胞为人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF

7或人宫颈癌细胞Hela。
[0018]本专利技术通过四(3

巯基丙酸)季戊四醇酯共价连接组氨酸残基,使咪唑基团在肿瘤细胞内形成聚集体,拉近了彼此距离,咪唑基之间从而发生去质子化过程提高了催化酯水解活性,使“turn

on”探针FN发荧光。然而在正常细胞内因活性氧含量较低,不发生聚集,所以不能催化酯水解,基于此实现对肿瘤细胞选择性诊断。本专利技术首次提供了响应胞内微环境及选择性诊断的人工酶。
附图说明
[0019]图1为式I所示化合物PTT

SGH的表征。
[0020]图2为式I所示化合物PTT

SGH的细胞毒性。
[0021]图3为式I所示化合物PTT

SGH在细胞内催化酯水解后的CLSM图。
[0022]图4为式I所示化合物PTT

SGH在混合细胞中选择性催化酯水解后的CLSM图。
具体实施方式
[0023]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0024]下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0025]下述实施例中所用的“turn

on”探针FN根据参考文献Li,G.,Liu,Y.,Song,J.et al.A Fluorescein

Based Colorimetric and Fluorescent Probe for Hydrazine and its Bioimaging in Live Cells.J Fluoresc,2017,27:323

329.中公开的方法制备合成。
[0026]实施例1:制备目标化合物(式I所示化合物)
[0027]97.8mg化合物四(3

巯基丙酸)季戊四醇酯(Pentaerythritol tetra(3

mercaptopropionate),简称PTT)、45.0mg化合物式II(由强耀生物科技有限公司合成,其与PTT的摩尔比为1:2)、如式Ⅱ所示化合物的1%摩尔量的正丙胺、10%摩尔量的TCEP溶解在3mL的无水DMF中,通氩气除氧30分钟,反应在常温无氧条件下搅拌24小时。加足量的水稀释后,通氩气用截留分子量为100~500Da的透析袋透析3天至小分子除去。冻干得到无色透明固体PTT

SGH。HR

MS(ESI,[M+H]+
):Calcd.for C
35
H
51
N6O
16
S4:939.22389,found:939.22400.如图1,可以看出,本实施例得到了目标化合物。
[0028]实施例2:式I所示化合物(PTT

SGH)对细胞的毒性
[0029]人肺癌细胞A549接种在96孔板内,密度为8
×
103个/孔,放入37℃细胞培养箱中过夜,待其贴壁。加入不同浓度的式I所示化合物(PTT

SGH),培养36小时后。接下来,加入混有MTT(0.5mg/mL,100μL/孔)的培养基,当在37℃细胞培养箱中放置4小时后,吸去上清,每孔加入100μL DMSO。然后用酶标仪读取570nm处的吸收值。
[0030]同样的操作应用于人乳腺癌细胞MCF

7、人宫颈癌细胞Hela、人肺成纤维细胞HPF。
[0031]各种条件下的细胞活性如图2所示,可以看出,对肿瘤细胞如:人肺癌细胞A549人乳腺癌细胞MCF

7、人宫颈癌细胞Hela,正常细胞人肺成纤维细胞HPF,PTT

SGH在100μM以下的浓度均有很好的细胞相容性。
[0032]实施例3:式I所示化合物(PTT

SGH)在人肺癌细胞A549、人肺成纤维细胞HPF中分别催化酯水解
[0033]人肺癌细胞A549接种在玻璃底的CLSM皿,密度为1
×
105个/皿,放入37℃细胞培养箱中过夜,待其贴壁。接下来,对照组中加入混有100μM PTT的DMEM,而实验组则加入100μM PTT

SGH,在37℃细胞培养箱中放置24小时后,每组都加入10μM FN,在37℃细胞本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.式Ⅱ所示化合物,2.式Ⅰ所示化合物,3.权利要求2所述化合物的制备方法,包括如下步骤:权利要求1所述式Ⅱ所示化合物与四(3

巯基丙酸)季戊四醇酯进行迈克尔加成反应即得。4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:所述迈克尔加成反应在无氧的条件下进行;所述迈克尔加成反应的温度为23~27℃,时间为12~24h。5.根据权利要求3或4所述的制备方法,其特征在于:所述迈克尔加成反应的溶剂为DMSO或DMF;式Ⅱ所示化合物与所述四(3

巯基丙酸)季戊四醇酯的摩尔比为1:2。6.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员:王树底宇飞刘礼兵吕凤婷黄一鸣
申请(专利权)人:中国科学院化学研究所
类型:发明
国别省市:

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