用于增强的淋巴细胞介导的免疫治疗的组合物和方法技术

公开了可用于免疫治疗的具有被抑制的自噬基因的淋巴细胞。淋巴细胞可表达抗原靶向受体，例如嵌合抗原受体(CAR)或者内源性或经改造T细胞受体，以靶向表达肿瘤特异性抗原的细胞。公开了制备和使用这样的淋巴细胞的方法。一些这样的淋巴细胞可用于进行CAR

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于增强的淋巴细胞介导的免疫治疗的组合物和方法
[0001]相关申请的引用
[0002]本申请要求于2019年2月12日提交的美国临时专利申请No.62/804658的优先权和权益，其全部内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
[0003]政府许可权
[0004]本专利技术部分地是在由美国陆军医学研究与发展部(U.S.Army Medical Research and Development Command)授予的授权号(Award Number)W81XWH
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0264下进行的基金号OC170169的政府支持下进行的。政府对本专利技术享有一定的权利。


[0005]本专利技术的一些实施方案涉及作为免疫治疗剂的具有改善效力的经遗传改造的淋巴细胞。本专利技术的一些实施方案涉及修饰淋巴细胞的代谢以改善其作为免疫治疗剂的效力的方法和组合物。一些实施方案涉及用于对嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T
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cell，CAR
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T)或者经改造或内源性T细胞受体T细胞(T cell receptor T
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cell，TCR
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T)中的自噬进行遗传操作以增强其针对癌症免疫治疗的有效性的方法。

技术介绍

[0006]用抗原结合结构域，例如抗体单链可变片段(single chain variable fragment，scFv)改造CAR
‑r/>T细胞以结合在肿瘤细胞的细胞表面上表达的抗原。在标准治疗中，将CAR构建体转导到自体CD3+T细胞中，体外扩增并随后输注到患者中。“新一代”CAR
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T细胞包含与共刺激分子(例如CD28、41BBL和CD27)组合融合的经优化的CD3ζ信号传导结构域(3)。尽管存在这些修饰，CAR
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T细胞在实体瘤中的持久性仍然很差。因此，除促存活信号之外的其他屏障控制CAR
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T细胞在肿瘤微环境中的功能。
[0007]尽管进行了数十年的研究，针对卵巢癌的治疗并没有改善患者结局。高级别浆液性癌(high
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grade serous carcinoma，HGSC)(最常见的组织类型)通常在3至4期疾病时被诊断出来，并且患者接受减积手术(debulking surgery)随后进行数轮化学治疗。4期疾病的5年存活率＜20％。虽然已经探究了疫苗、检查点阻断和T细胞治疗，但早期试验并未改善总体患者存活。然而，有明确的证据表明，肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)的存在和功能与存活的提高强烈相关，这意味着免疫系统对该疾病有益(4)。
[0008]叶酸受体(folate receptor，FR)以3种同种型α、β和γ存在，并在叶酸和叶酸盐摄取中发挥作用。已观察到αFR在卵巢癌、乳腺癌和肺癌中水平高，但在正常组织中水平低(5)。在一项试验中，接受有或没有IL
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2的αFR
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CAR
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T细胞输注的14名卵巢癌患者没有表现出临床应答的证据，尽管治疗具有良好的耐受性。作者使用放射性标记示踪剂成像得出结论：αFR
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CAR
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T细胞在输注之后不久就不能够持续存在(2)。因此，目前在卵巢癌中使用αFR
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CAR
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T的方法并不成功，部分是由于输注之后细胞缺乏持久性。然而，这项工作为αFR
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CAR
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T治疗提供了确定的安全谱。
[0009]制备CAR
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T细胞需要专用的基础设施，患者必须在T细胞输注之前经历淋巴细胞耗竭(lymphodepletion)，并且可出现急性的危及生命的不良免疫事件。此外，CAR
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T细胞在实体瘤中已显示出效力有限(6)。解释对于实体瘤缺乏观察到的效力的一种可能性是肿瘤生态系统由于迅速增殖的肿瘤细胞的高代谢需求而施加的代谢屏障。最终，这可导致T细胞功能和持久性的丧失。因此，似乎代谢可显著影响T细胞行为，这为修饰T细胞代谢并在实体癌症中实现更好的治疗成功提供了独特的机会。
[0010]中央代谢失调是癌症的普遍标志，经报道这在卵巢癌中观察到(7)。普遍认识到，癌症以高速率使用葡萄糖和谷氨酰胺作为细胞生长和增殖的主要生物合成前体(8)。最近的工作表明，T细胞根据其活化和分化状态具有适应性代谢(7、9至12)。例如，从原初T细胞转变为活化的效应细胞伴随着从氧化代谢转变为更多的糖酵解表型(9)。增殖的T细胞和肿瘤细胞的代谢相似性是显著的，并且意味着葡萄糖和支持增殖所必需的其他营养物不足可导致T细胞功能降低和耗竭(10)。
[0011]代谢竞争可抑制已作为T细胞治疗的一部分而被输注的T细胞。一份报道发现，与具有高的糖酵解率的肿瘤相比，鼠肿瘤中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在具有降低的葡萄糖消耗的肿瘤中功能更强，这表明肿瘤的葡萄糖消耗直接损害了T细胞活性(10)。这种缺陷通过表达恢复T细胞糖酵解的代谢酶来挽救。在另一份报道中，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中线粒体质量的损失与1型细胞因子减少、检查点抑制剂表达提高和抗肿瘤活性丧失相关(13)。然而，PGC1α(参与线粒体生物合成的转录因子)的强制表达恢复了抗肿瘤免疫。在面对代谢压力时，重编程TIL以使用替代刺激物(fuel)可帮助维持其抗肿瘤活性。尽管进行了这些研究，仍没有报道研究本专利技术人已知的代谢对人TIL的作用。
[0012]自噬是分解代谢的一种形式，其中细胞吞没部分胞质溶胶并降解溶酶体中的细胞内容物，以进行代谢物回收、蛋自质质量控制或破坏受损细胞器(14)。自噬主要是由营养和生长因子剥夺激活的存活途径(14)。缺乏自噬基因(例如Atg5或Atg7)的T细胞会损害胸腺细胞的发育并减少外周T细胞(15)。与此一致的是，已报道自噬对于CD8+效应T细胞存活和记忆发育至关重要(16，17)。
[0013]鉴于代谢在生物体内稳态和癌症中发挥的基本作用，可预期与操纵自噬途径相关的有害或原致癌性表型。在自噬缺陷的情况下，已发现一个自噬基因Beclin
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1的单倍剂量不足(haploinsufficency)促进肿瘤形成，并且在40％至75％的散发性乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中观察到单等位基因缺失(18)。此外，老化Atg5或Atg7肝特异性敲除会发展为自发性肝肿瘤(19)。根据本专利技术人自己的观察，认为T细胞中Atg5的丧失不会导致癌发生。此外，代谢基因的功能获得或功能损失是肿瘤发生所必需的，但不足以导致肿瘤发生。例如，T细胞特异性Glut1转基因小鼠不会自发地发生肿瘤(20)。
[0014]已有在原代人T细胞中使用CRISPR/Cas9进行基因编辑的报道(21，22)。一个中国小组已成功敲除T细胞中的PD
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1，但其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.淋巴细胞，其包含抗原靶向受体和被抑制的自噬基因。2.根据权利要求1所述的淋巴细胞，其包含编码所述抗原靶向受体的核酸，所述核酸插入所述自噬基因的基因座内以破坏所述自噬基因的表达。3.根据权利要求2所述的淋巴细胞，其中编码所述抗原靶向受体的核酸插入所述自噬基因的基因座内，以使得所述抗原靶向受体的表达由所述自噬基因的内源性启动子调节。4.根据权利要求1至3中任一项所述的淋巴细胞，其中编码所述抗原靶向受体的核酸插入所述自噬基因的外显子内。5.根据权利要求1至3中任一项所述的淋巴细胞，其中编码所述抗原靶向受体的核酸插入所述自噬基因的内含子内，任选地其中所述自噬基因是ATG5并且编码所述抗原靶向受体的核酸插入所述ATG5基因的内含子2内，并且还任选地其中用于插入所述抗原靶向受体的核酸具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9之一的序列。6.根据权利要求1所述的淋巴细胞，其中所述自噬基因位于所述淋巴细胞的基因组的第一基因座，并且所述淋巴细胞包含位于所述基因组的第二基因座的编码所述抗原靶向受体的核酸，所述第一基因座与所述第二基因座不同。7.根据权利要求6所述的淋巴细胞，其中所述抗原靶向受体的表达由异源启动子调节。8.用于免疫治疗的淋巴细胞，其包含被抑制的自噬基因。9.根据权利要求1至8中任一项所述的淋巴细胞，其中所述自噬基因被消除，或其中所述自噬基因被RNAi抑制。10.进行免疫治疗的方法，其包括向对象施用根据权利要求1至9中任一项所述的淋巴细胞。11.使用淋巴细胞进行免疫治疗的方法，所述方法包括向对象施用已被修饰以抑制自噬基因的淋巴细胞。12.使用淋巴细胞进行免疫治疗的方法，所述方法包括向对象施用已被修饰以表达抗原靶向受体并抑制自噬基因的淋巴细胞。13.治疗癌症的方法，所述方法包括进行根据权利要求10至12中任一项所述的免疫治疗的步骤。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述癌症是B细胞急性淋巴母细胞白血病(B
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ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤或其他淋巴恶性肿瘤、肝癌、胰腺癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、胶质瘤、EGFR
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阳性实体瘤、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、胃癌、鼻咽癌、食管癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、肝细胞癌、鳞状细胞肺癌、MSLN
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阳性实体瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、肉瘤、晚期实体瘤、肾细胞癌、中枢神经系统癌或ROR1
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阳性恶性肿瘤；并且任选地其中所述癌症是卵巢癌、乳腺癌或肺癌。15.制备用于免疫治疗的淋巴细胞的方法，所述方法包括修饰所述淋巴细胞以抑制自噬基因的步骤。16.根据权利要求15所述的方法，其还包括修饰所述淋巴细胞以表达抗原靶向受体。17.根据权利要求15或16中任一项所述的方法，其中修饰所述淋巴细胞以抑制所述自噬基因的步骤和修饰所述淋巴细胞以表达所述抗原靶向受体的步骤之一或二者使用基因编辑方法或使用RNAi进行，其中所述基因编辑方法任选地包括CRISPR
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Cas。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述基因编辑方法用于在所述自噬基因的基因座处插入编码所述抗原靶向受体的核酸。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述基因编辑方法用于插入编码所述抗原靶向受体的核酸，以使得所述抗原靶向受体的表达由所述自噬基因的内源性启动子调节。20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述基因编辑方法用于将编码所述抗原靶向受体的所述核酸插入所述自噬基因的内含子中，任选地其中所述自噬基因是ATG5并且将编码所述抗原靶向受体的所述核酸插入ATG5基因的内含子2中，还任选地其中用于插入所述抗原靶向受体的核酸构建体包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9之一的序列，并且还任选地其中所述基因编辑方法包括CRISPR
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Cas，并且用于进行所述CRISPR
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Cas基因编辑的sgRNA包含SEQ ID NO：1至7之一。21.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中修饰所述淋巴细胞以表达所述抗原靶向受体的步骤包括将编码所述抗原靶...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱利安，
申请(专利权)人：拉瓦尔大学，
类型：发明
国别省市：