基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及方法技术

技术编号:30529578 阅读:30 留言:0更新日期:2021-10-27 23:19
本发明专利技术公开了一种基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及方法,所述试剂盒包括正向引物,和纳米银针SERS基底,所述纳米银针SERS基底由5

【技术实现步骤摘要】
基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于生物医学检测
,更具体地说,本专利技术涉及一种基于拉曼光谱对新型冠状病毒核酸进行检测的试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]核酸是生命最基本的遗传物质,开展核酸分子诊断对促进人类健康医疗的发展具有重要意义。表面增强拉曼光谱(SERS)是对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息,是一种快速无损检测技术,具有制样简单、水的干扰小、非侵入、实时检测等优点,在核酸检测、病原微生物检测、肿瘤精准分子诊断等领域展现出良好的应用潜力。
[0003]目前已有许多科研小组开展了基于SERS技术的核酸检测研究,如采用拉曼分子和寡核苷酸探针链修饰金纳米颗粒构建SERS探针,在基片表面修饰链与目标链和SERS探针杂交形成三明治检测结构进行DNA检测[ Y.W.C. Cao, R.C. Jin, C.A. Mirkin, Nanoparticles with raman spectroscopic fingerprints for DNA and rna detection, Science 297 (2002) 1536

1540];又如以银纳米颗粒为核酸标记探针拉曼分子并包裹二氧化硅壳(Ag nanorice@MGITC@SiO2)作为SERS探针,利用光刻技术在硅圆片上形成三角状金纳米膜作为SERS活性检测基底,实现了乙型肝炎病毒检测[ Y. Liu, P.Y. Wu, Meditating metal coenhanced fluorescence and sers around gold nanoaggregates in nanosphere as bifunctional biosensor for multiple DNA targets, Acs Appl. Mater. Interface 5 (2013) 5832

5844.];Cui小组以银纳米棱镜作为基底,以4

MBA拉曼活性分子作为标记、探针寡核苷酸修饰的金纳米颗粒作为SERS探针,在水溶液中直接进行DNA检测[ M. Li, S.K. Cushing, H.Y. Liang, S. Suri, D.L. Ma, N.Q. Wu, Plasmonic nanorice antenna on triangle nanoarray for surface

enhanced raman scattering detection of hepatitis b virus DNA, Anal. Chem. 85 (2013) 2072

2078];Mirkin小组采用固态金属膜SERS基片构建检测多元基底,分别制作标记不同的拉曼探针分子、与目标检测物互补的探针链结合的SERS探针,开展多种病原检测[ R.C. Jin, Y.C. Cao, C.S. Thaxton, C.A. Mirkin, Glass

bead

based parallel detection of DNA using composite raman labels, Small 2 (2006) 375

380]。随着SERS研究的深入及多学科领域的交叉发展,SERS技术有望广泛应用于核酸检测以及整个生物医学检测领域,为生命科学提供一种强大的分析技术。
[0004]2020年新型冠状病毒(2019

nCoV或SARS

CoV

2)在世界范围内疫情爆发,从政府端、医院临床端、产业端到普通百姓,对于病原微生物感染的认知和重视都达到前所未有的高度,不管对新型冠状病毒的临床检测还是进行实验室研究,如何快速、高效的检测新型冠状病毒核酸成为重中之重。
[0005]传统的聚合酶链式反应检测,由于需要复杂的核酸提取步骤、精确的升降温设备和专业的操作,限制了其在基层一线检测现场的普及,有待进一步提高检测的及时性。迫切
需要研发检测更方便、更快捷的核酸检测试剂盒及检测方法。
[0006]现场检测是SERS发展的一个重要方向,目前已经有多种便携式仪器,也有与之相匹配的高灵敏便携式SERS基底,可以将拉曼光谱信号放大一百万倍,因此,可考虑利用SERS基底进行新冠肺炎病毒的核酸检测。
[0007]传统基于SERS的核酸检测方法,虽然不同论文采取的策略不同,但比较一致的就是利用拉曼峰强度差异来定量检测,判断阴性和阳性。2016年的Nanoscale中的一篇论文(Nanoscale, 2016, 8, 17365

17373)中公开了一种基于SERS的核酸检测方法,其是通过在SERS基底上面修饰发卡结构,一端通过

SH连在SERS基底上,一端修饰拉曼报告分子,由于发卡结构,报告分子比较靠近于SERS基底,因此有较强的SERS信号。当特征序列过来,发卡结构打开,报告分子远离SERS基底,因此SERS信号减弱,故可通过SERS信号的强弱变化来判断目标序列以及其浓度。但是由于修饰探针的浓度影响,SERS信号没有具体的数值。
[0008]这种基于SERS的核酸检测方法,需要满足以下几个条件:1、因为是通过信号强度来判断阴性和阳性,所以SERS基底需要有很好的均一性(即不同激光光斑下的SERS强度比较一致),然而SERS基底主要增强来自于2~10纳米的间隙(也称作“hot spots”),Science上也有论文报道SERS信号的80%来自于极少数 hot spots的贡献(Science, 321 (2008) 388

392),但是,现在的控制工艺很难控制到10纳米以下的结构,因此真正意义上超高均一性的SERS基底比较难以实现,这也是为什么行业将强度的重复性的范围定义在20%的原因之一(ACS Nano 2020, 14, 28

117)。
[0009]2、即使构筑了十分均一的SERS基底,分子的修饰分布也会影响SERS信号的均一性。由于这个策略里面是利用发卡结构的变化来区别阴性和阳性的样本,从原理来看,信号减弱不明显,当目标核酸的量很小时,难度将变得更大。
[0010]3、SERS的强度影响因素。SERS是分子吸附在贵金属的粗糙纳米级表面,在合适激光激发下,使得拉曼光谱增强百万倍的现象。即使排除激光和SERS基底均一性的影响,分子在检测过程中可能会有热运动,分解或者其他变化。
[0011]此外,本专利技术的专利技术人最近的研究表明,分子的取向(即分子以什么角度吸附在SERS基底上面,J. Phys. Chem. Lett., 2019, 10(10), 2306

2312.)对SERS的信号强度影响极大。
[0012]因此,利用拉曼峰强度差异来定量检测核酸的方法准确度和可靠度本文档来自技高网
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒,其特征在于,包括:(1)、正向引物;(2)、纳米银针SERS基底,所述纳米银针SERS基底是由5

端有巯基修饰的反向引物与纳米银针共价连接而得。2.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒,其特征在于,所述纳米银针是通过电化学工艺制备而成,包括以下步骤:先将银针依次在乙醇、丙酮和水中超声清洗;再将银针置于1M
±
0.1M硝酸中进行电化学处理,即得;所述电化学处理包括5个~10个周期,每个周期的操作方法为:将银针置于阳极电流持续8秒~10秒,再置于阴极电流持续8秒~10秒。3.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒,其特征在于,所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示,所述反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求3所述的基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒,其特征在于,所述正向引物的5

端有FAM修饰。5.根据权利要求1~4任一项所述的基于拉曼光谱的新型冠状病毒核酸检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括溶解剂、RT

基础扩增试剂和激活剂。6.一种基于拉曼光谱的非诊断目的的新型冠状病毒核酸检测的方法,其特征在于,所述方法获取拉曼光谱信号的位移差异,包括以下步骤:(1)、采集纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号,所述纳米银针SERS基底是由5

端有巯基修饰的反向引物与纳米银针共价连接而得;(2)、将步骤(1)的纳米银针SERS基底插入包含待检测样品的反应溶液中,进行恒温扩增;(3)、恒温扩增反应结束后,取出纳米银针SERS基底,采集纳米银针SERS基底的拉曼光谱信号,并与步...

【专利技术属性】
技术研发人员:欧小华吕坚缪夏萍周彬斌黄晓强李扬扬于世辉欧玮辉沈君达程雅婷
申请(专利权)人:香港城市大学深圳研究院广州市金域转化医学研究院有限公司广州金域医学检验集团股份有限公司
类型:发明
国别省市:

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