一种油橄榄营养体体细胞胚胎发生及植株再生的方法技术

本发明专利技术公开了一种油橄榄营养体体细胞胚胎发生及植株再生方法，属于植株组织培养技术领域，所述方法包括以下步骤：对营养体(幼嫩枝叶、未裂花粉囊)进行灭菌，将灭菌后的营养体置于胚性愈伤组织诱导培养基上，进行第一暗培养，得到胚性愈伤组织；再将获得的胚性愈伤组织置于体细胞胚胎发生培养基进行第二暗培养；待愈伤组织表面长出胚状体并发育至子叶胚时期后，置于光照培养基进行光照培养，直至形成再生植株，将再生植株驯化后移栽。本发明专利技术的方法可以高效便捷地获得高质量体细胞胚胎再生植株。植株。植株。

【技术实现步骤摘要】
一种油橄榄营养体体细胞胚胎发生及植株再生的方法


[0001]本专利技术涉及植株组织培养
，更具体的说是涉及一种油橄榄营养体体细胞胚胎发生及植株再生的方法。

技术介绍

[0002]随着社会经济发的发展，橄榄油的营养、保健和医疗价值逐渐被人们认识和接受，橄榄油消费量急剧增长，巨大的市场空间和良好的经济效益促进油橄榄在多个省份开展种植，从而推动种苗需求的旺盛。
[0003]目前油橄榄种苗繁殖的方法包括扦插繁殖和嫁接繁殖。其中扦插繁殖的扦插苗无明显主根，根系生长较浅，且根系喜好中性偏碱的土壤，对于土质有较高要求，在一定程度限制了油橄榄的大规模培育。嫁接繁殖一般采用实生砧木。实生砧木主要依靠实生种子获得，但由于油橄榄实生种子存在休眠现象，萌发后生长较为缓慢，且对果肉处理要求较高，处理不善极易导致实生种子萌发失败，影响且限制了实生砧木的大规模培育。因此，扦插繁殖受土质的限制以及嫁接繁殖受砧木类型的限制，无法实现橄榄油苗的大规模繁育。
[0004]为了实现橄榄油苗的大规模繁育，现有技术逐步探索油橄榄组织培养方法，例如CN 109511551 A公开了一种体细胞胚胎发生及植株再生方法，具体是：将油橄榄果实去除果肉，取出果核，然后将所述果核用细沙反复进行揉刷，充分去除果核上的残余果肉，将果核干燥后放入温水中浸泡后，再将果核破开取出种仁；用尖嘴镊和手术刀分离胚和子叶；再将分离的胚和子叶分别置于胚性愈伤组织诱导培养基上进行暗培养。该方法虽然实现了油橄榄的组织培养，但是其以胚和子叶作为外植体，外植体获取过程繁琐，操作复杂。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种油橄榄营养体体细胞胚胎发生及植株再生的方法，该方法以幼嫩枝叶和/或未裂花粉囊作为外植体，外植体获取简单，操作简便。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种一种油橄榄营养体体细胞胚胎发生方法，包括以下步骤：
[0008]1)对营养体进行灭菌，将灭菌后的营养体置于胚性愈伤组织诱导培养基上，进行第一暗培养，得到胚性愈伤组织；
[0009]所述营养体包括幼嫩枝叶和/或未裂花粉囊；
[0010]2)将所述胚性愈伤组织置于体细胞胚胎发生培养基上，进行第二暗培养至胚性愈伤组织表面长出胚状体且胚状体发育至子叶胚时期，获得子叶胚状体。
[0011]优选的，步骤1)中所述胚性愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，还包括以下质量浓度的组分：2,4D 1.0～3.0mg/L、6
‑
BA 0.1～0.2mg/L、蔗糖30～40g/L和琼脂7～10g/L；所述胚性愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8～6.5。
[0012]优选的，步骤1)中所述第一暗培养的温度为22～25℃；所述第一暗培养的时间为25～35d。
[0013]优选的，步骤1)中所述对枝叶或花粉进行灭菌的方法包括依次采用酒精浸泡和升汞水溶液；所述酒精浸泡包括：采用体积浓度为70％～80％的酒精浸泡20～30s；所述升汞水溶液浸泡包括：采用0.08～0.15％的升汞浸泡8～15min。
[0014]优选的，步骤2)中所述第二暗培养的温度为22～25℃；所述第二暗培养的时间为60～70d。
[0015]优选的，步骤2)中所述第二暗培养包括第一次继代培养和第二次继代培养；
[0016]所述第一次继代培养采用第一次继代培养基；所述第一次继代培养基以MS为基础培养基，还包括以下质量浓度的组分：IAA 1.0～3.0mg/L、KT0.2～0.3mg/L、6
‑
BA 0.1～0.5mg/L、蔗糖35～45g/L和琼脂7～10g/L；所述第一次继代培养基的pH为5.8～6.5；
[0017]所述第二次继代培养采用第二次继代培养基；所述第二次继代培养基以MS为基础培养基，还包括以下质量浓度的组分：IAA 1.0～3.0mg/L、KT0.1～0.2mg/L、6
‑
BA 0.1～0.3mg/L、蔗糖35～50g/L和琼脂7～10g/L；所述第二次继代培养基的pH为5.8～6.5；
[0018]所述第一次继代培养和第二次继代培养的时间独立为25～35d，条件分别为暗培养，温度独立为22～25℃。
[0019]本专利技术还提供了一种油橄榄植株再生的方法，包括以下步骤：
[0020]按照上述方案所述方法获得子叶胚状体；将所述子叶胚状体转移至增殖培养基，进行光照培养至形成再生植株。
[0021]优选的，所述增殖培养基以MS基本培养基，还包括以下浓度的组分：蔗糖25～30g/L、和琼脂7～10g/L和活性炭0.8～2g/L所述增殖培养基的pH值为5.8～6.5。
[0022]优选的，所述光照培养的光照强度为5000～8000lux；所述光照培养的时间为60～90d；光照周期为光培养16h，暗培养8h，所述光照培养的温度为22～25℃。
[0023]优选的，所述形成再生植株后，还包括将所述再生植株驯化后移栽。
[0024]本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种油橄榄营养体体细胞胚胎发生及植株再生的方法，本专利技术以营养体(幼嫩枝叶和/或未裂花粉囊)作为外植体，在无菌条件下进行体细胞胚胎发生，有效的解决了现有技术通过种子进行体细胞胚胎发生的所导致的遗传分化难题，保证了子代与母本间的遗传一致性；同时，营养体体细胞发生技术可以破解传统扦插繁殖根系主根不明显导致的油橄榄抗风能力较弱和嫁接繁殖出现的基因交流问题，以类合子胚的发育方式，可以完整地形成主根突出，根系生长旺盛的油橄榄品种苗，从而拓宽油橄榄的种植范围和加速品种苗木的规模化扩繁；并通过营养体(幼嫩枝叶和/或未裂花粉囊)的体细胞胚胎发生，可以获得更多油橄榄单倍体，这位开展分子育种和细胞工程育种提供了高效的技术支持。因此本专利技术提供的固体培养方式，形成稳定的油橄榄体细胞胚胎发生体系，将幼嫩枝叶和/或未裂花粉囊的植物干细胞繁殖成胚性愈伤组织，进一步诱导发育获得类合子胚的发育路径，实现植物体细胞无性系化繁殖，破解传统扦插繁殖的主根不明显、嫁接繁殖的亲和性和基因交流和组织培养的过程繁琐等问题，从而更加高效便捷地获得高质量体细胞胚胎再生植株，建立出稳固、高频、操作简单、苗木抗性良好的油橄榄营养体固体培养基体细胞胚胎发生体系。并且本专利技术的营养体体细胞胚胎发生及植株再生方法周期短、繁殖率高、成本低廉，还可以完整保留母本所有性状。
附图说明
[0025]图1为油橄榄体细胞胚胎发生过程中的实物图，其中A为球形胚，B为心形胚，C为鱼雷胚，D为子叶胚，E为油橄榄幼苗；
[0026]图2为鄂植8号体胚生长及幼苗，其中左侧为体胚，右侧为幼苗；
[0027]图3为花粉体胚生长及幼苗，其中左侧为体胚，右侧为幼苗。
具体实施方式
[0028]本专利技术提供了一种油橄榄营养体体细胞胚胎发生方法，包括以下步骤：
[0029]1)对营养体进行灭菌，将灭菌后的营养体置于胚性愈本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种油橄榄营养体体细胞胚胎发生方法，包括以下步骤：1)对营养体进行灭菌，将灭菌后的营养体置于胚性愈伤组织诱导培养基上，进行第一暗培养，得到胚性愈伤组织；所述营养体包括幼嫩枝叶和/或未裂花粉囊；2)将所述胚性愈伤组织置于体细胞胚胎发生培养基上，进行第二暗培养至胚性愈伤组织表面长出胚状体且胚状体发育至子叶胚时期，获得子叶胚状体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述胚性愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，还包括以下质量浓度的组分：2,4D1.0～3.0mg/L、6
‑
BA 0.1～0.2mg/L、蔗糖30～40g/L和琼脂7～10g/L；所述胚性愈伤组织诱导培养基的pH值为5.8～6.5。3.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述第一暗培养的温度为22～25℃；所述第一暗培养的时间为25～35d。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述对枝叶或花粉进行灭菌的方法包括依次采用酒精浸泡和升汞水溶液；所述酒精浸泡包括：采用体积浓度为70％～80％的酒精浸泡20～30s；所述升汞水溶液浸泡包括：采用0.08～0.15％的升汞浸泡8～15min。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述第二暗培养的温度为22～25℃；所述第二暗培养的时间为60～70d。6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述第二暗培养包括第一次继代培养和第二次继代培养；所述第一次继代培养采用第一次继代培养基；所述第一次继代培养基以MS为基础...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙伟，姚小华，任华东，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院亚热带林业研究所，
类型：发明
国别省市：