一种具有心肌靶向性的基因递送载体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种具有心肌靶向性的基因递送载体及其制备方法，涉及基因递送载体技术领域。本发明专利技术的递送载体包括空白载体与DNA，其中，空白载体与DNA的质量比例为25：1；所述空白载体包括DOTAP、大豆卵磷脂、DOPE

【技术实现步骤摘要】
一种具有心肌靶向性的基因递送载体及其制备方法


[0001]本专利技术属于基因递送载体
，特别是涉及一种具有心肌靶向性的基因递送载体及其制备方法。

技术介绍

[0002]冠心病是指冠状动脉粥样硬化使血管腔狭窄、阻塞或痉挛，导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病，亦称缺血性心脏病。冠心病已成为全世界人民关注的大难题，也是现今人类所亟待解决的疾病。
[0003]基因治疗是指在靶细胞，将正常基因细胞导入其中，表达正常细胞的蛋白质，以达到治疗的目的，基因治疗药物与手术治疗，传统药物治疗等方法治疗疾病相比，具有副作用小，靶向性强等优点，已成为现今研究治疗许多疾病的大发展方向。1993年，Wilson等应用低密度脂蛋白受体(LDL
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R) 基因治疗家族性高胆固醇血症，这是基因治疗首次在心血管病相关领域实现临床应用。近年来，心血管病基因治疗占全部基因治疗临床研究的比例逐渐增加，在美国，该比例从1994年的3％上升至2000年的17％；基因治疗的对象也从单基因遗传的心血管病扩展到多基因心血管病，如高血压病和冠心病，有望为这些疾病的治疗开拓一片新的天地。
[0004]为了将一种基因转移入适当的细胞需要一个载体，合适载体的选择，是决定基因治疗是否有效的关键因素之一。可以搭载基因进入细胞的载体有很多，包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体能够高效感染哺乳动物细胞，但病毒基因整合到宿主染色体，其安全性尚未得到确证，具有潜在的风险。
[0005]本专利技术采用脂质体作为基因递送载体，制备阳离子脂质体用于DNA的载带和在细胞内表达。阳离子脂质体已用于体内或体外的基因转染，此类非病毒载体最早出现于20世纪80年代末，主要用于血管基因的转移。阳离子脂质体可自动、快速地与多聚阴离子如DNA、mRNA等相互作用，阳离子脂质体的体积较小，可以包裹较大的核酸片段，同源性也较高，与生物膜的脂质双分子层接触性良好，DNA内容物可通过阳离子脂质体与生物膜的脂质双分子层之间的融合直接进入目标细胞。在阳离子脂质体介导的动脉血管基因转移的研究中，已建立了多种动物模型，如正常的和动脉粥样硬化的大鼠、兔、犬和猪等。结果表明，阳离子脂质体载体的一大显著优势即是其高安全性，经静脉或动脉给予阳离子脂质体引起机体的生化及血流动力学改变和心脏毒性反应均很轻微。另外，阳离子脂质体的制备也比较容易。
[0006]然而脂质体和基因本身靶向性差，对心脏组织无靶向选择性，因此以脂质体作为心肌组织的基因递送载体需考虑用配体进行修饰提高靶向性。
[0007]另外，用细胞穿膜肽TAT和特异性心肌靶向肽PCM共同修饰的脂质体载药可以增强其心肌靶向性，所以本专利技术拟用细胞穿膜肽TAT和特异性心肌靶向肽PCM共同修饰的脂质体搭载增强绿色荧光蛋白表达质粒构建基因递送系统，通过体外评价对此基因递送系统的心肌靶向性进行初步评价。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种具有心肌靶向性的基因递送载体，以解决了现有的问题：脂质体和基因本身靶向性差，对心脏组织无靶向选择性，因此以脂质体作为心肌组织的基因递送载体需考虑用配体进行修饰提高靶向性。
[0009]为解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0010]本专利技术为一种具有心肌靶向性的基因递送载体，所述递送载体包括空白载体与DNA，其中，空白载体与DNA的质量比例为25：1；
[0011]所述空白载体包括DOTAP、大豆卵磷脂、DOPE
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mPEG1000、胆固醇、TAT 和PCM。
[0012]其中，所述TAT和PCM分别占空白载体总脂质摩尔量的1％和3％；
[0013]所述DOTAP、大豆卵磷脂、DOPE
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mPEG1000、胆固醇的摩尔比为2:4:1:3。
[0014]上述的基因递送载体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0015]称取一定量的DOTAP、大豆卵磷脂、DOPE
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mPEG1000、胆固醇，使其四者摩尔比满足上述的比例，并放置在茄形瓶内；
[0016]加入有机溶剂氯仿使其充分溶解，在旋转蒸发仪上抽成均匀的薄膜,真空干燥挥干有机溶剂后，向茄形瓶里加入PBS，并作用一段时间；
[0017]用探头超声在规定功率下作用相应时间后经PBS溶液透析过夜，次日取出即得阳离子脂质体，于冰箱在特定温度下贮存备用；
[0018]精密称取一定量的TAT和PCM，加水溶解备用；
[0019]取一定量的DOPE
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mPEG1000
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Mal，使其与多肽的摩尔比均为1：12，用三氯甲烷溶解，于旋转蒸发仪上旋转抽成均匀的薄膜，分别加入TAT和PCM 溶液制得胶束溶液；
[0020]分别将胶束溶液以1％和3％的浓度加入普通阳离子脂质体中，在室温下振摇孵育达到设定时间，透析过夜，分别得到TAT和PCM修饰阳离子脂质体的1％TAT
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LIP和3％PCM
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LIP，以及TAT和PCM共同修饰的阳离子脂质体1％TAT
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3％PCM
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LIP；
[0021]将上述脂质体加入不同质量的质粒，用PBS稀释至相同体积，室温震荡孵育达到设定时间，即可制得本基因递送载体。
[0022]其中，向茄形瓶里加入PBS，并作用一段时间，为在37℃、120rpm水化条件下作用1h。
[0023]其中，用探头超声在规定功率下作用相应时间后经PBS溶液透析过夜，次日取出即得阳离子脂质体，于冰箱在特定温度下贮存备用，主要包括，用探头超声在150w功率下作用7min后经PBS溶液透析过夜，次日取出即得阳离子脂质体，于冰箱在4℃下贮存备用；
[0024]其中，加入TAT和PCM溶液制得胶束溶液，主要包括，加入TAT和PCM 溶液后在37℃恒温环境下震荡1h制得胶束溶液；
[0025]其中，分别将胶束溶液以1％和3％的浓度加入普通阳离子脂质体中，在室温下振摇孵育达到设定时间，透析过夜，主要包括，分别将胶束溶液以1％和3％的浓度加入普通阳离子脂质体中，在室温下振摇孵育3h，透析过夜；
[0026]其中，用PBS稀释至相同体积，室温震荡孵育达到设定时间，主要包括，用PBS稀释至相同体积，室温震荡孵育20min。
[0027]本专利技术具有以下有益效果：
[0028]本专利技术采用生物相容性很好的脂质体作为基因递送载体的母体，克服了脂质体靶
向性差、基因递送效果差的缺点，引入了两种不同作用的多肽进行修饰，该基因递送系统在心肌细胞内具有较高的基因表达效率。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0030]图1为本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有心肌靶向性的基因递送载体，其特征在于，所述递送载体包括空白载体与DNA，其中，空白载体与DNA的质量比例为25：1；所述空白载体包括DOTAP、大豆卵磷脂、DOPE
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mPEG1000、胆固醇、TAT和PCM。2.根据权利要求1所述的一种具有心肌靶向性的基因递送载体，其中，所述TAT和PCM分别占空白载体总脂质摩尔量的1％和3％；所述DOTAP、大豆卵磷脂、DOPE
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mPEG1000、胆固醇的摩尔比为2:4:1:3。3.上述权利要求1
‑
2任意一项所述基因递送载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1.称取一定量的DOTAP、大豆卵磷脂、DOPE
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mPEG1000、胆固醇，使其四者摩尔比满足上述的比例，并放置在茄形瓶内；S2.加入有机溶剂氯仿使其充分溶解，在旋转蒸发仪上抽成均匀的薄膜,真空干燥挥干有机溶剂后，向茄形瓶里加入PBS，并作用一段时间；S3.用探头超声在规定功率下作用相应时间后经PBS溶液透析过夜，次日取出即得阳离子脂质体，于冰箱在特定温度下贮存备用；S4.精密称取一定量的TAT和PCM，加水溶解备用；S5.取一定量的DOPE
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mPEG1000
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Mal，使其与多肽的摩尔比均为1：12，用三氯甲烷溶解，于旋转蒸发仪上旋转抽成均匀的薄膜，分别加入TAT和PCM溶液制得胶束溶液；S6.分别将胶束溶液以1％和3％...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈华黎，周露，刘学燕，谢娜，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：