一种固定化双酶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种固定化双酶及其制备方法与应用。本发明专利技术公开的一种固定化双酶包含固定化载体和交联在所述固定化载体上的葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶。本发明专利技术可以实现低聚糖益生元与益生菌的联产，有效提高生产效率，降低成本，可用于低聚果糖工业化生产。可用于低聚果糖工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种固定化双酶及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种固定化双酶及其制备方法与应用，尤其是在一锅法制备低聚果糖以及联产布拉氏酵母中的应用。

技术介绍

[0002]低聚糖是2～4个单糖通过糖苷键连接而成的低聚化合物，常见的低聚糖有低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖等。它们难以被胃肠消化吸收，甜度低，热量低，基本不增加血糖和血脂，可以作为糖尿病人以及肥胖人群的食品甜味剂。并且，低聚糖虽然不能被人体分解和吸收，但是通过消化道到达结肠后，却能被肠道内益生菌(例如乳酸杆菌、双歧杆菌等)分解和利用，而促进益生菌群的生长，有效改善肠道微生态，维持人体的身体健康。此外，低聚糖还具有维持肠道正常功能、防止便秘、促进矿物质吸收、改善脂质代谢等诸多效用，成为食品添加剂和保健品领域的研究热点。
[0003]低聚果糖(FOS)是应用最广泛的低聚糖之一，由蔗糖和一定分子量的果糖反应，有着良好的保湿型、吸湿性、非胰岛素依赖性，能够促进乳酸杆菌、双歧杆菌和链球菌等有益菌在消化道中的生长，抑制有害细菌，改善肠道菌群。低聚果糖的生产方法有菊芋水解法、黑曲霉发酵法、固定化细胞法或固定化酶法。但是酶法或发酵法生产得到的低聚果糖含量并不高，为50％-60％，这些产品也含有大量未反应的葡萄糖或者果糖。这些副产物不但降低了低聚果糖的功能，也造成糖尿病人、肥胖者不能食用的局限，从而限制了低聚果糖的应用。目前工业上利用凝胶过滤色谱法、纳滤法、离子交换色谱法、模拟移动床色谱法等来对低聚果糖溶液进行提纯。以上这些方法会存在产品纯度受限、处理流程复杂、不能大规模生产、膜材料或色谱材料污染、废水量大、原料单耗高成本高等问题，因此，开发一种制备高纯度低聚果糖的方法是十分重要的。
[0004]目前，有学者采用具有较弱转化酶活性的酵母，经培养后添加于低聚果糖的酶促反应液中，经反应后，可以在一定程度上提高低聚果糖的纯度(60％至80％)。但是，这样的反应只是将蔗糖水解为葡萄糖和果糖，没有将这些单糖消耗掉，还需要进行纳滤或色谱等操作步骤除去反应液中的单糖以提高低聚糖的纯度，成本上和实际应用上都不占优势，需要进行改进和提高。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，高效制备高纯度低聚果糖。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种固定化双酶，其包含固定化载体和交联在所述固定化载体上的葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶。
[0007]在一些实施方案中，上述固定化双酶中，所述固定化载体为纳米微球，优选为聚丙烯酰胺纳米微球。
[0008]在一些实施方案中，上述任一所述的固定化双酶中，所述交联使用的交联剂为乙烯砜类交联剂，优选为二乙烯砜。
[0009]为解决上述技术问题，本专利技术还提供一种制备上述任一所述的固定化双酶的方法，包括将固定化载体加入葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的混合溶液中，搅拌，优选在15-30℃下搅拌，使葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶吸附于所述固定化载体上，离心，得到吸附了葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的固定化载体沉淀，再将沉淀加入到交联剂溶液中，搅拌，优选在2-8℃下搅拌，使所述葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶交联在所述固定化载体上，离心，得到的沉淀即为所述固定化双酶。
[0010]在一些实施方案中，上述制备固定化双酶的方法中，所述固定化载体与所述葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的混合溶液的比例为10g:100ml-20g:100ml。
[0011]在一些实施方案中，上述任一所述的制备固定化双酶的方法中，所述葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的混合溶液含有1％-5％的葡萄糖异构酶和3％-10％的β-呋喃果糖苷酶；所述葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的混合溶液优选为葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的PBS溶液，pH为7.4。
[0012]在一些实施方案中，上述任一所述的制备固定化双酶的方法中，所述15-30℃搅拌时间为2-5小时。
[0013]在一些实施方案中，上述任一所述的制备固定化双酶的方法中，所述吸附了葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的固定化载体沉淀与所述交联剂溶液的质量比为1:10。
[0014]在一些实施方案中，上述任一所述的制备固定化双酶的方法中，所述交联剂溶液的浓度为2％-8％。
[0015]在一些实施方案中，上述任一所述的制备固定化双酶的方法中，2-8℃搅拌时间为2-5小时。
[0016]在一些实施方案中，上述任一所述的制备固定化双酶的方法中，所述固定化载体为纳米微球，优选为聚丙烯酰胺纳米微球。
[0017]在一些实施方案中，上述任一所述的制备固定化双酶的方法中，所述交联剂为乙烯砜类交联剂，优选为二乙烯砜，更优选为二乙烯砜水溶液，如2％-8％的二乙烯砜水溶液。
[0018]为解决上述技术问题，本专利技术还提供一种制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法，包括以下步骤：在葡萄糖溶液中加入上述任一所述的固定化双酶，进行酶催化反应，离心终止反应，得到上清液，其是低聚果糖、葡萄糖和果糖的混合液，低聚果糖含量为50％-60％，其余为葡萄糖和果糖；在所述上清液中加入无机盐和糖苷酶抑制剂(糖苷酶抑制剂抑制低聚果糖的水解)，得到培养基；将益生酵母菌接入所述培养基进行发酵，使益生酵母菌消耗反应液中未聚合的葡萄糖或果糖而不能消耗掉低聚果糖，达到提纯低聚果糖的目的，得到发酵液；将所述发酵液离心，得到的上清即为低聚果糖溶液，所述低聚果糖溶液的浓度为93％以上，可高达97％，沉淀即为益生酵母菌，所述益生酵母菌的湿重为200g/L以上，可高达400g/L。
[0019]在一些实施方案中，上述制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法中，所述葡萄糖溶液的浓度为20％-60％。
[0020]在一些实施方案中，上述任一所述的制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法中，所述固定化双酶与所述葡萄糖溶液的比例为20g:100ml-50g:100ml。
[0021]在一些实施方案中，上述任一所述的制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法中，所述酶催化反应的反应温度为25-40℃，反应时间为6-12小时。
[0022]在一些实施方案中，上述任一所述的制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法中，所述无机盐为硫酸铵、尿素、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和硫酸镁，在所述培养基中所述硫酸铵的终浓度为2.5-5g/L，尿素的终浓度为2.5-5g/L，磷酸二氢钾的终浓度为5-8g/L，磷酸氢二钾的终浓度为1-5g/L，硫酸镁的终浓度为0.2-1g/L。
[0023]在一些实施方案中，上述任一所述的制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法中，所述糖苷酶抑制剂为1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-3,4,5-哌啶三醇，在所述培养基中1-(2-羟乙基)-2-(羟甲基)-3,4,5-哌啶三醇的终浓度为0.03-0.1g/L。
[0024]在一些实施方案中，上述任一所述的制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法中，所述益生酵母菌是将达到接种标准的种子液以5％-20％的体积比接入所述培养基中的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固定化双酶，其包含固定化载体和交联在所述固定化载体上的葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶。2.根据权利要求1所述的固定化双酶，其特征在于：所述固定化载体为纳米微球，优选为聚丙烯酰胺纳米微球；和/或所述交联使用的交联剂为乙烯砜类交联剂，优选为二乙烯砜。3.一种制备权利要求1或2所述的固定化双酶的方法，包括将固定化载体加入葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的混合溶液中搅拌，优选在15-30℃下搅拌，使葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶吸附于所述固定化载体上，离心，得到吸附了葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的固定化载体沉淀，再将沉淀加入到交联剂溶液中，搅拌，优选在2-8℃下搅拌，使所述葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶交联在所述固定化载体上，离心，得到的沉淀即为所述固定化双酶。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述固定化载体与所述葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的混合溶液的比例为10g:100ml-20g:100ml；和/或所述葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的混合溶液含有1％-5％的葡萄糖异构酶和3％-10％的β-呋喃果糖苷酶；和/或所述吸附了葡萄糖异构酶和β-呋喃果糖苷酶的固定化载体沉淀与所述交联剂溶液的质量比为1:10；和/或所述交联剂溶液的浓度为2％-8％。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述固定化载体为纳米微球，优选为聚丙烯酰胺纳米微球；和/或所述交联剂为乙烯砜类交联剂，优选为二乙烯砜。6.一种制备低聚果糖并联产益生酵母菌的方法，包括以下步骤：...

【专利技术属性】
技术研发人员：单雨瑶，王竞辉，杨付伟，张永振，黎源，孙烨，黄真真，
申请(专利权)人：万华化学集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：