一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒及其检测方法、判定方法和用途技术

本申请涉及病毒检测的技术领域，具体公开了一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒及其检测方法、判定方法和用途。该试剂盒包括：包被能够与非洲猪瘟病毒抗体特异性结合的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板、酶结合物、标准阳性对照品、标准阴性对照品、样本稀释液、浓缩洗液、底物溶液、终止液；以及该试剂盒的检测方法、判定方法和用途。本申请提供的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白及其试剂盒，能够用于非洲猪瘟病毒抗体的检测。够用于非洲猪瘟病毒抗体的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒及其检测方法、判定方法和用途


[0001]本申请涉及病毒检测的
，更具体地说，它涉及一种用于非洲猪瘟病毒阻断 ELISA抗体检测的试剂盒及其检测方法、判定方法和用途。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus， ASFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、出血性、烈性传染病，死亡率高达100％。 ASF被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。 ASFV为有囊膜的双链DNA病毒，是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属 (Asfivirus)的唯一成员。其可感染家猪和野猪引起高热、广泛性出血热和高死亡率， 而对于非洲野猪，如疣猪和非洲丛林野猪则呈隐性感染。非洲钝缘蜱属(Ornithodoros) 的软蜱是ASFV的自然宿主和传播媒介。
[0003]ASF最早于1921年在肯尼亚被确认，目前主要在撒哈拉以南的非洲地区、意大利 撒丁岛、高加索地区以及俄罗斯和东欧部分国家流行，给疫区国家的养猪业造成巨大的 经济损失。
[0004]然而，截至目前，我国以及其他国家均未批准非洲猪瘟疫苗的上市使用。未经严格 程序批准生产经营使用的疫苗都是假疫苗，安全风险隐患极大。因此，研发用于非洲猪 瘟病毒抗体检测的试剂盒具有重要的现实意义。

技术实现思路

[0005]为了提高对非洲猪瘟病毒的检测和监控，本申请提供一种用于非洲猪瘟病毒阻断 ELISA抗体检测的试剂盒及其检测方法、判定方法和用途。
[0006]第一方面，本申请提供一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，采 用如下的技术方案：
[0007]一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，所述试剂盒包括：包被能 够与非洲猪瘟病毒抗体特异性结合的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板、酶结合 物、标准阳性对照品、标准阴性对照品、样本稀释液、浓缩洗液、底物溶液、终止液。
[0008]通过采用上述技术方案，利用包被能够与非洲猪瘟病毒抗体特异性结合的非洲猪 瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板制备的试剂盒，通过非洲猪瘟病毒P32重组蛋白与 非洲猪瘟病毒抗体的特异性结合，实现对非洲猪瘟病毒抗体的检测。
[0009]本申请利用阻断ELISA原理，以非洲猪瘟病毒P32重组蛋白作为抗原，利用包被 液将非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被在酶标反应板上。将样本稀释液和待测样本加入酶 标反应板的样本孔中，若待测样本中存在特异性非洲猪瘟病毒抗体，将形成抗原
‑
抗体 复合物，从而覆盖非洲猪瘟病毒P32重组蛋白表位。弃去多余的溶液，并利用浓缩洗液 洗涤。
[0010]然后继续向样本孔中加入含有酶标抗体的酶结合物，酶标抗体会与剩余的游离非
洲 猪瘟病毒P32重组蛋白表位结合，从而形成抗原
‑
酶标抗体复合物。其中，酶标抗体为 利用抗P32
‑
辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体。利用浓缩洗液洗涤，去除过量的酶标 抗体。
[0011]再继续向样本孔中加入底物溶液(TMB)，避光反应后，继续加入终止液，完成显 色反应。显色反应的结果取决于待测样本中特异性抗体的含量：若待测样本中不存在抗 体时，将看到蓝色，加入终止液后变成黄色；若待测样本中不存在抗体时，没有显色反 应。最后利用酶标仪检测酶标反应板上各孔对应的OD
450nm
，将显色反应的结果转化为 数据，从而获得待测样本中非洲猪瘟病毒抗体的检测结果。
[0012]优选的，所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
[0013]通过采用上述技术方案，本申请提供了非洲猪瘟病毒P32重组蛋白，以该非洲猪 瘟病毒P32重组蛋白为抗原，其能够特异性结合非洲猪瘟病毒抗体，故能够对待测样本 中的非洲猪瘟病毒抗体进行检测。通过检测以及对检测结果的分析，能够计算出待测样 本中的非洲猪瘟病毒抗体。因此，本申请提供的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白可用于检测 非洲猪瘟病毒抗体，基于该非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的特异性，可将其应用于非洲猪 瘟病毒抗体检测的研发，从而推动我国非洲猪瘟病毒抗体检测事业的发展。
[0014]利用包被液将上述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被在酶标反应板上，制成包被非 洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板。将待测样本加入包被非洲猪瘟病毒P32重组 蛋白的酶标反应板后，当待测样本中含有非洲猪瘟病毒抗体时，酶标反应板上的非洲猪 瘟病毒P32重组蛋白能够与待测样本中的非洲猪瘟病毒抗体特异性结合，形成抗原
‑
抗 体复合物，并通过利用生物学手段对抗原
‑
抗体复合物进行检测，从而能够检测获得待 测样本中的非洲猪瘟病毒抗体。
[0015]优选的，所述包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板中的非洲猪瘟病 毒P32重组蛋白的浓度为2.5
‑
5μg/mL。
[0016]在一个具体的实施方案中，所述包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应 板中的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度为5μg/mL。
[0017]优选的，将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板中的包被温度为2～ 8℃。
[0018]优选的，将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的包被液 为磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)。
[0019]优选的，将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的封闭液 为0.2％BSA。
[0020]优选的，所述酶结合物的稀释度为1:250～1:2000。
[0021]通过对酶标反应板中非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度、包被非洲猪瘟病毒P32 重组蛋白的包被液、封闭液、包被温度以及酶结合物的稀释度进行检测，当上述参数 处于上述范围内时，利用本申请提供的试剂盒对于待测样本中的非洲猪瘟病毒抗体的检 测结果越精确和高效。
[0022]第二方面，本申请提供一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒的检 测方法，采用如下的技术方案：
[0023]一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒的检测方法，所述检测方法 具体包括以下步骤：
[0024](1)将样本稀释液分别与待测样本、标准阳性对照品、标准阴性对照品在酶标反应 板的样本孔内混合，并于37℃的避光条件下反应；
[0025](2)弃去步骤(1)各孔内的溶液，用浓缩洗液洗涤，并去除多余水分；
[0026](3)分别向步骤(2)处理后的各孔内加入酶结合物，并于37℃的避光条件下反应；
[0027](4)弃去步骤(3)处理后的各孔内的溶液，用浓缩洗液洗涤，并去除多余水分；
[0028](5)分别向步骤(4)处理后的各孔内加入底物溶液，并于21℃的避光条件下反本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被能够与非洲猪瘟病毒抗体特异性结合的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板、酶结合物、标准阳性对照品、标准阴性对照品、样本稀释液、浓缩洗液、底物溶液、终止液。2.根据权利要求1所述的一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。3.根据权利要求2所述的一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于，所述包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板中的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度为2.5
‑
5μg/mL。4.根据权利要求3所述的一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于：将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板中的包被温度为2～8℃。5.根据权利要求3所述的一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于：将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的包被液为磷酸盐缓冲液（pH=7.2）。6.根据权利要求3所述的一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于：将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的封闭液为0.2%BSA。7.根据权利要求1所述的一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于：所述酶结合物的稀释...

【专利技术属性】
技术研发人员：马增彬，杨若松，葛辉，郭琦，张桂林，徐凤忠，张强，王学文，龚雅云，梁健平，蔡云虹，杨天意，张璐，田小，
申请(专利权)人：百沃特北京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：