用温度响应型无规共聚醚EO制造技术

本发明专利技术涉及一种用温度响应型环氧乙烷环氧丙烷无规共聚醚EO

【技术实现步骤摘要】
用温度响应型无规共聚醚EO
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沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法


[0001]本专利技术涉及分离纯化
，特别涉及溶剂沉淀法分离纯化蛋白质
，具体是一种用温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO
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沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶。

技术介绍

[0002]谷氨酰胺转移酶(transglutaminase,TGase)在食品行业经常被用来修饰蛋白质的功能特性，其最显著的特性就是其交联性能，被广泛用于改善蛋白质的溶解度、乳化性能以及凝胶性能。另外，TGase的应用不仅仅局限于食品加工行业，在其他领域诸如生物医药、材料科学、生物医学工程、皮革加工和纺织等领域也发挥着重要的作用。
[0003]链霉菌通常被工业上用作生产TGase的主要菌株，鉴于其产量不高，通过底物优化、代谢优化以及环境控制策略(pH、溶解氧和温度)提高TGase的产量，但是仍然不足以满足生产需求。于是许多研究致力于提高TGase的产量，将基因重组技术运用于生产菌株的构建改良。另一种提高TGase产量的关键在于TGase的分离纯化。一般来说，上述菌体的发酵液首先会经过离心去除菌体，然后通过超滤对蛋白质进行浓缩得到粗品，最后再通过层析(离子交换层析、凝胶色谱层析等)对TGase进行纯化，但传统用于TGase分离纯化的方法经过纯化之后得率并不高，并且这些方法所涉及到的各种色谱法纯化过程复杂，成本比较昂贵，不利于规模放大。
[0004]环氧乙烷
‑/>环氧丙烷(ethylene oxide
‑
propylene oxide,EOPO)共聚物是一类通过开环反应得到的热响应型聚合物，聚合方式包括无规聚合和嵌段聚合。具有高度亲水性的EO和高度疏水性的PO的比例不同，所合成的EOPO在性质方面(特别是最低临界溶液温度，LCST)会有很大的差别，通过改变EO/PO的配比，共聚物的疏水性和亲水性可以得到调节，使其广泛用作洗涤剂、破乳剂、消泡剂、分散剂和保湿剂等。EOPO被加热到其LCST以上时，可发生相分离，因此，基于EOPO的热分离两水相体系已广泛应用于多肽、药物分子等的分配研究。但是在以往研究中，EOPO几乎都是与无机盐(如K3PO4、Na2SO4、(NH4)2SO4等)或可再生聚合物(如葡聚糖和淀粉衍生物)一起构建两水相体系来分离生物大分子物质。

技术实现思路

[0005]本专利技术为了解决传统的超滤和层析(离子交换层析、凝胶色谱层析等)等纯化谷氨酰胺转氨酶方法存在的问题，提供一种操作简单，成本低廉，谷氨酰胺转氨酶得率高，作为沉淀剂的聚合物无毒且可回收利用，可大规模应用于谷氨酰胺转氨酶纯化的方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种用温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO
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沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法，其主要特点是：
[0007]所述的方法包括以下步骤：
[0008](1)：将EO
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与谷氨酰胺转氨酶发酵液混合；
[0009](2)：向混合液中加入盐离子溶液，混合均匀，调节混合液pH至6.0
‑
9.0，静置沉淀；
[0010](3)：通过离心得到谷氨酰胺转氨酶沉淀，经洗涤去除残留的共聚物和一些杂质，干燥得到谷氨酰胺转氨酶；
[0011](4)：重新溶解干燥后的谷氨酰胺转氨酶，测定产品的蛋白含量和酶活力单位，并用电泳法定性检测产品的纯度；
[0012](5)：回收共聚物EO
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。
[0013]较佳地，所述的步骤(1)中EO
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溶液的比例为5
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50％。
[0014]较佳地，所述的步骤(2)中所述的盐离子溶液为氯化钠、氯化镁或氯化钙溶液，其浓度为0
‑
50mM。
[0015]较佳地，所述的步骤(2)中所述的调节混合液pH值使用氢氧化钠和盐酸溶液。
[0016]较佳地，所述的步骤(3)中以4000rpm离心10min，对上清液取样检测酶活力单位。
[0017]较佳地，所述的步骤(3)中用沉淀湿重2
‑
3倍体积的20％
‑
50％的乙醇对沉淀进行洗涤，次数为0
‑
2次，用冷冻干燥机对沉淀进行干燥，得到谷氨酰胺转氨酶产品。
[0018]较佳地，所述的步骤(4)中测定干燥后的产品中蛋白含量的方法为考马斯亮蓝法，测定产品酶活力单位的方法为氧肟酸比色法，采用SDS
‑
PAGE法定性鉴定谷氨酰胺转氨酶产品的纯度。
[0019]较佳地，所述的步骤(5)中使用步骤(3)中离心得到的上清液，于40
‑
80℃的恒温水浴锅内静置成相，弃掉成相后的上相(发酵液)，向下相(共聚物EO
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)中加入0
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3倍体积的去离子水对共聚物EO
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进行洗涤，重复上述步骤即可回收温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO
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。
[0020]本专利技术提供的用温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO
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沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法的有益效果在于：采用温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO
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沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶，首先对比传统的超滤和层析(离子交换层析、凝胶色谱层析等)等纯化谷氨酰胺转氨酶方法，操作简便，通过简单的一步沉淀基本可将发酵液中的谷氨酰胺转氨酶全部沉淀。其次使用其他温度响应型聚合物分离酶会造成部分酶失活，酶活力回收率通常不高；且普通的温度响应型聚合物选择性低，造成沉淀的纯度低，通过对比发现EO
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毒性低，提供温和的环境，大大减少了酶活力的损失。另外EOPO聚合物用来分离纯化发酵液时，通常是通过构建两水相体系实现的，从来没有用作沉淀剂使用，EO
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作为温度响应型共聚物，可以通过简单的调节温度对其进行回收，重复利用，降低了生产成本。通过本专利技术提供的用温度响应型环氧乙烷环氧丙烷共聚物EO
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沉淀法分离的谷氨酰胺转氨酶，酶活力回收率最高可达120％，对比发酵液中TGase的比活提高了40倍；此外，EO
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可通过简单的调节温度得到回收，回收率达到98％以上。
附图说明
[0021]图1为本专利技术实施例3、4的SDS
‑
PAGE电泳结果，其中，Lane 1为实施例3得到的谷氨酰胺转氨酶(1m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用温度响应型无规共聚醚EO
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沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：(1)：将EO
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与谷氨酰胺转氨酶发酵液混合；(2)：向混合液中加入盐离子溶液，混合均匀，调节混合液pH至6.0
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9.0，静置沉淀；(3)：通过离心得到谷氨酰胺转氨酶沉淀，经洗涤去除残留的共聚物和杂质，干燥得到谷氨酰胺转氨酶。2.根据权利要求1所述的用温度响应型无规共聚醚EO
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沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中EO
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溶液的比例为5～50％。3.根据权利要求1所述的用温度响应型无规共聚醚EO
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沉淀法分离谷氨酰胺转氨酶的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹学君，杨婷，徐小峰，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：