一种噬菌体复合粉剂及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种噬菌体复合粉剂，包括以重量份计的噬菌体发酵液1

【技术实现步骤摘要】
一种噬菌体复合粉剂及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物制剂领域，具体涉及一种噬菌体复合粉剂的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]由于早期药物滥用，细菌耐药性形势严峻，严重影响食品安全和公共卫生。在养殖端“减抗、限抗”形势下，噬菌体因能有效裂解细菌被作为一种新型的潜在“抗菌剂”备受关注。噬箘体不仅有望替代抗生素用于治疗细菌感染，并可用于清除动物肠道内特定的有害菌群，维持动物肠道健康。
[0003]目前噬菌体技术主要在畜牧业、环保、农业和疾病治疗等领域得到应用。在畜牧业领域主要用在大肠杆菌和沙门氏菌感染的预防和治疗上，如仔猪黄白痢、雏鸡白痢、猪伤寒、副伤寒及成年鸡大肠杆菌感染引发的肝周炎、心包炎、气囊炎、输卵管炎和肠炎等方面的治疗。
[0004]现有噬菌体液体制剂常温下一个月会下降2
‑
3个数量级，并且噬菌体液体制剂保存过程中，很容易受到其他杂菌的污染。粉剂有利于噬菌体的保存和防止杂菌污染，但目前粉剂制备技术很难保证噬菌体在保质期内的存活率，尤其是在干燥、高温、酸碱等环境中，很多噬菌体会出现死亡，故需要通过制剂技术进行优化。常用的微生物制剂如益生菌等，通常采用冷冻干燥的办法做成粉剂，虽能保持微生物的活性，但冷冻干燥成本高，能耗大，在饲料等粉剂上难以推广应用。Joan等将沙门菌噬菌体包封在脂质体后在4℃下能储存3个月，也可以加入饮用水和动物饲料(Appl Environ Microbiol,2015,81(14):4841
‑
4849.)，但该方法给制剂制备步骤繁琐，难度大，也不利于工业化生产。

技术实现思路

[0005]针对现有噬菌体制剂制备步骤繁琐、保藏难、存活率低的问题，本申请提供一种低成本的低温鼓风、真空干燥或低温真空喷雾干燥方法制备的噬箘体固体复合粉剂，以提高制剂中噬箘体的存活率，并延长制剂货架期。
[0006]具体而言，本申请是通过如下技术方案实现的：
[0007]本申请首先提供了一种噬菌体复合粉剂，其组成组分为：以重量份计，噬菌体发酵液1
‑
4份，嵌段式聚醚0.02
‑
0.1份，羟基磷灰石0.002
‑
0.05份，载体4
‑
16份；该粉剂中噬菌体含量>3.1
×
109PFU/g。
[0008]进一步而言，本申请提供的噬菌体复合粉剂中，载体可以选择米糠、麸皮、玉米芯粉、豆粕、玉米粉、秸秆粉、鱼粉、肉骨粉、脱脂奶粉、麦芽糊精、玉米淀粉、乳清粉等常见载体中的一种或多种。
[0009]进一步而言，本申请提供的噬菌体复合粉剂中，噬菌体发酵液制备如下：将噬菌体及其对应的宿主菌同时加入LB液体培养基，37℃培养6
‑
18个小时，离心(10000转，10分钟)、过滤除菌(0.22μM聚醚砜)，超滤(100KD超滤膜)除去培养基即得，该发酵液中噬箘体的效价≥10
11
CFU/mL；
[0010]LB液体培养基配方(1L)：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，以蒸馏水补足余量。
[0011]进一步而言，本申请提供的噬菌体复合粉剂中，嵌段式聚醚包括聚醚F
‑
68(泊洛沙姆188)、或嵌段式聚醚F
‑
127(泊洛沙姆407)中的至少一种。
[0012]进一步而言，本申请提供的噬菌体复合粉剂中，使用的羟基磷灰石，优选纳米羟基磷灰石，或微米级的羟基磷灰石。
[0013]本申请中，术语“噬菌体及其对应的宿主菌”是指本领域常规的噬菌体及其宿主，如宿主菌沙门氏菌CMCC13076的噬菌体PA13076，宿主菌大肠杆菌K88的噬菌体JS
‑
15，宿主菌鸡白痢沙门氏菌s96116的噬菌体JS116等。
[0014]其次，本申请还提供了上述噬菌体复合粉剂的制备方法，其具体步骤如下：
[0015]1)向效价≥10
11
CFU/mL的噬菌体发酵液中加入嵌段式聚醚，37℃，180rpm，包被1
‑
6个小时，获得包被后的噬菌体；37℃有利于嵌段式聚醚对噬菌体进行包被；
[0016]2)然后向包被后的噬菌体中加入羟基磷灰石，搅拌均匀，37℃，180rpm振荡1
‑
2个小时，再加入载体，搅拌均匀，获得粉剂前体，备用；
[0017]或者，将羟基磷灰石与载体水溶液混合均匀，获得混合溶液；再将步骤1)制备的包被后的噬菌体溶解于该混合溶液中，获得粉剂溶液，备用；
[0018]3)将步骤2)获得的粉剂前体或粉剂溶液干燥至恒重，即得噬菌体复合粉剂。
[0019]进一步而言，上述步骤3)“干燥”是指：10
‑
70℃鼓风干燥或真空干燥的方式将粉剂前体干燥至恒重；或者，以喷雾干燥的方式将粉剂溶液的方式干燥至恒重；喷雾干燥参数优选：120℃，通针时间间隔96s,蠕动速度15rpm。
[0020]第三，本申请提供了上述噬菌体复合粉剂在作为饲料添加剂中的应用。
[0021]第四，本申请还提供了上述噬菌体复合粉剂在制备防治牲畜腹泻药物或其原料中的应用。
[0022]与现有噬箘体制剂相比，本专利技术提供的噬菌体复合粉剂的不仅噬菌体含量高(噬菌体含量>3.1
×
109PFU/g)，而且提高了噬菌体的抗胃酸能力与常温下长期保存的稳定性。其中嵌段式聚醚可以对噬菌体进行包被，在噬菌体的表面形成一层保护膜，增强噬菌体在干燥、保存与使用过程中的稳定性。羟基磷灰石可以在酸性(如胃酸)条件下释放出氢氧根，中和噬菌体周围的氢离子，避免噬菌体失活；将包被后的噬菌体负载于载体可以提高噬菌体的稳定性，提高成粉率。
附图说明
[0023]图1肠炎沙门氏菌噬菌体复合米糠照片。
[0024]图2肠炎沙门氏菌噬菌体复合玉米淀粉照片。
[0025]图3肠炎沙门氏菌噬菌体复合麦芽糊精照片。
[0026]图4大肠杆菌噬菌体复合玉米粉照片。
[0027]图5不同包被剂对于噬菌体的保护作用检测结果示意图。
[0028]图6不同嵌段式聚醚PF
‑
68添加量对于噬菌体的保护作用示意图。
[0029]图7纳米羟基磷灰石提高噬菌体复合粉剂的耐胃酸性能检测结果示意图。
[0030]图8噬菌体复合粉剂的常温保存稳定性检测示意图。
具体实施方式
[0031]下面将结合本专利技术的具体实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0032]实施例试剂来源：
[0033]段式聚醚F
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68及嵌段式聚醚F
‑
127购自生工生物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种噬菌体复合粉剂，其特征在于，该复合粉剂组分为：以重量份计，噬菌体发酵液1
‑
4份，嵌段式聚醚0.02
‑
0.1份，羟基磷灰石0.002
‑
0.05份，载体4
‑
16份；所述复合粉剂中噬菌体含量＞3.1
ꢀ×ꢀ
10
9 PFU/g。2.如权利要求1所述的噬菌体复合粉剂，其特征在于，所述载体包括米糠、麸皮、玉米芯粉、豆粕、玉米粉、秸秆粉、鱼粉、肉骨粉、脱脂奶粉、麦芽糊精、玉米淀粉、乳清粉中的至少一种。3.如权利要求1所述的噬菌体复合粉剂，其特征在于，所述噬菌体发酵液是这样获得的：将噬菌体及其对应的宿主菌同时加入LB液体培养基中，37 o
C培养6
‑
18个小时，离心、过滤除菌， 超滤除去培养基即得，所述发酵液中噬箘体的效价≥10
11 CFU/mL。4.如权利要求1所述的噬菌体复合粉剂，其特征在于，所述嵌段式聚醚为聚醚F
‑
68或聚醚F
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王合叶，王冉，张莉莉，包红朵，魏瑞成，张辉，何涛，周艳，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：