经修饰用于转谷氨酰胺酶缀合的抗体、其缀合物以及方法和用途技术

通过用选择的含谷氨酰胺的替代序列替代重链CH1、CH2或CH3或轻链恒定区中的氨基酸来修饰抗体，以使其易于通过酶即转谷氨酰胺酶缀合。合。合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经修饰用于转谷氨酰胺酶缀合的抗体、其缀合物以及方法和用途
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2018年12月12日提交的美国临时申请序列号62/778,437的35 U.S.C.
§
119(e)下的权益；将其公开内容通过引用并入本文。序列表
[0002]通过引用以其整体并入本文的是命名为“181031_SEQT_13143WOPCT_YC.txt”的序列表，其包含包括本文公开的核酸和/或氨基酸序列的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:103。序列表已经通过EFS
‑
Web以ASCII文本格式随同提交，因此构成了其纸质和计算机可读形式。序列表最初是在2018年10月31日使用PatentIn 3.5创建的，并且大小为约39KB。

技术介绍

[0003]本公开文本涉及可由酶即转谷氨酰胺酶缀合的经修饰的抗体和由此类抗体制备的缀合物。
[0004]已引起目前强烈关注的一种类型的生物制剂是其中抗体与配偶体分子共价连接的生物制剂(“抗体
‑
药物缀合物”、“ADC”、“缀合物”或“免疫缀合物”)。因此，缀合物包含三种组分：(1)所述抗体、(2)所述配偶体分子和(3)共价接合前两种组分的接头。
[0005]所述配偶体分子可以是治疗剂，如抗癌药物、佐剂、另一种蛋白质或放射性同位素。所述抗体是其抗原由靶细胞或组织表达的抗体。所述抗体通过其与抗原的结合而用于将所述缀合物递送至靶标。一旦到达那里，共价连接的切割或抗体的降解导致治疗剂在靶标位置处的释放。相反，当所述缀合物在血液系统中循环时，所述治疗剂由于其与抗体的共价连接而保持无活性，从而降低了副作用的风险。关于在抗癌治疗中的缀合物的综述，参见Gerber等人2013。
[0006]作为治疗剂的替代，所述配偶体分子可以是用于诊断、定位疾病部位或监测医学状况的测定剂。在此类情况下，所述测定剂可以是例如生物素、荧光标记、放射性标记或氘代聚合物。Smith等人2019披露了用于MRI成像的包含氘代聚合物的缀合物。在此类情况下，在靶位点处的接头的切割不是必需的，并且实际上可能是不希望的。对于此类用途，可以将接头设计为不可切割的类型。
[0007]在制备缀合物中的关键步骤是共价连接步骤，也称为缀合步骤。已经披露了用于实现缀合的许多方法。最近引起人们极大兴趣的方法是由酶即转谷氨酰胺酶(EC 2.3.2.13)介导的缀合。
[0008]已知许多转谷氨酰胺酶变体，其由不同的生物体自然产生或由生物工程制备。食品工业中常用于组织化(texturing)蛋白质的转谷氨酰胺酶变体是通过发酵或重组表达获得的茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)转谷氨酰胺酶。在本文中，除非指明特定的类型或来源，否则通常使用术语“转谷氨酰胺酶”。
[0009]转谷氨酰胺酶在谷氨酰胺(胺受体，或相对地，酰基供体)的甲酰胺侧链与赖氨酸(胺供体，或相对地，酰基受体)的ε
‑
氨基基团之间形成酰胺键。就特异性而言
(Specificity
‑
wise)，转谷氨酰胺酶关于谷氨酰胺残基具有选择性，要求所述谷氨酰胺残基位于蛋白质环的柔性部分中，并且侧接某些氨基酸，但是关于赖氨酸残基则是各式各样的，例如容易接受亚烷基氨基化合物的氨基基团作为赖氨酸ε
‑
氨基替代物。参见Fontana等人2008。
[0010]在典型的转谷氨酰胺酶介导的缀合中，谷氨酰胺残基位于抗体上，而氨基基团位于接头
‑
配偶体分子部分上，如下所示：
[0011]谷氨酰胺残基在多肽链上的定位对其作为胺受体的可行性具有很大影响。通常，抗体上的谷氨酰胺残基均不可用，并且需要抗体的一些修饰以使其可用。典型地，使抗体在重链的天冬酰胺297(N297)处糖基化(N
‑
连接的糖基化)。Jeger等人2010披露了通过N297A取代消除糖基化位点或翻译后酶促去糖基化进行的抗体的去糖基化使得附近的谷氨酰胺295(Q295)可用于通过茂原链霉菌(S.mobaraensis)转谷氨酰胺酶的转酰胺基反应。他们进一步显示N297Q取代不仅消除糖基化，而且还引入也作为胺受体的第二谷氨酰胺残基(在位置297处)。因此，简单的去糖基化产生每个抗体两个转谷氨酰胺酶反应性谷氨酰胺残基(每条重链一个，在Q295处)，而具有N297Q取代的抗体具有四个此类谷氨酰胺残基(每条重链两个，在Q295和Q297位置处)。
[0012]除了由Jeger等人2010披露的N297A和N297Q取代外，存在关于修饰抗体或另一种蛋白质以使其成为转谷氨酰胺酶的底物的其他公开文本。(a)Strop等人2017和Farias等人2016披露了用含有谷氨酰胺的标签(如LLQGG、LSLSQG、GGGLLQGG、GLLQG等)工程化的抗体Fc区，其中所述标签中的谷氨酰胺可以充当胺受体并且位于抗体重链或轻链的多个位置(包括其羧基末端)处。(b)Chen等人2005披露了用QSKVX标签修饰蛋白质，其中X是L或I，然后所述蛋白质可以与转谷氨酰胺酶缀合。(c)Fischer等人2015披露了将下式的含有谷氨酰胺(Q)的标签掺入缺乏Fc结构域的抗体片段中：(Q)
‑
NH
‑
(C)
‑
X
‑
L
‑
(V
‑
(Y
‑
(M或Z)
z
)
q
)
r
。(d)Rao
‑
Naik等人2018披露了将含有谷氨酰胺的重链C末端延伸附加到抗体上以使其具有转谷氨酰胺酶反应性。
[0013]在修饰抗体以使其具有转谷氨酰胺酶反应性的补充方法中，Rao
‑
Naik等人2017披露了修饰转谷氨酰胺酶以使其能够与野生型抗体缀合。
[0014]还已经使用含有小肽的分子研究了转谷氨酰胺酶的底物特异性：Ando等人1989、Kamiya等人2011、Ohtsuka等人2000。
384至402处的氨基酸；(xii)用SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:69的氨基酸替代重链的EU 414至419处的氨基酸；(xiii)用SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的氨基酸替代轻链的EU 122至126处的氨基酸；(xiv)用SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75的氨基酸替代轻链的EU 152至155处的氨基酸；(xv)用SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82的氨基酸替代轻链的EU 167至170处的氨基酸；(xvi)用SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种全长IgG抗体，所述全长IgG抗体具有选自以下的修饰：(i)用SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸替代重链的EU 131至135处的氨基酸；(ii)用SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸替代重链的EU 160至164处的氨基酸；(iii)用SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或NO:20的氨基酸替代重链的EU175至177处的氨基酸；(iv)用SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的氨基酸替代重链的EU 190至196处的氨基酸；(v)用SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ NO:28的氨基酸替代重链的EU 264至269处的氨基酸；(vi)用SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸替代重链的EU 280至284处的氨基酸；(vii)用SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ Id NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:103的氨基酸替代重链的EU 292至297处的氨基酸；(viii)用SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的氨基酸替代重链的EU 314至319处的氨基酸；(ix)用SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53的氨基酸替代重链的EU 330至331处的氨基酸；(x)用SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:55的氨基酸替代重链的EU 358至362处的氨基酸；(xi)用SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64的氨基酸替代重链的EU 384至402处的氨基酸；(xii)用SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:69的氨基酸替代重链的EU 414至419处的氨基酸；(xiii)用SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的氨基酸替代轻链的EU 122至126处的氨基酸；(xiv)用SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75的氨基酸替代轻链的EU 152至155处的氨基酸；(xv)用SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82的氨基酸替代轻链的EU 167至170处的氨基酸；(xvi)用SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:87的氨基酸替代轻链的EU 182至190处的氨基酸；以及(xvii)用SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SSEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:96的氨基酸替代轻链的EU 199至204处的氨基酸。2.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体是IgG1抗体。
3.根据权利要求2所述的抗体，其中所述修饰是在重链中。4.根据权利要求2所述的抗体，其中所述修饰选自：(I)用SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸替代重链的EU 131至135处的氨基酸；(II)用SEQ ID NO:18的氨基酸替代重链的EU 175至177处的氨基酸；(III)用SEQ ID NO:22的氨基酸替代重链的EU 190至196处的氨基酸；(IV)用SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的氨基酸替代重链的EU 264至269处的氨基酸；(V)用SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:103的氨基酸替代重链的EU 292至297处的氨基酸；(VI)用SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53的氨基酸替代重链的EU 330至331处的氨基酸；(VII)用SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:63的氨基酸替代重链的EU 384至402处的氨基酸；(VIII)用SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68的氨基酸替代重链的EU 414至419处的氨基酸；(IX)用SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:75的氨基酸替代轻链的EU 152至155处的氨基酸；(X)用SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:82的氨基酸替代轻链的EU 167至170处的氨基酸；以及(XI)用SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:94的氨基酸替代轻链的EU 199至204处的氨基酸。5.根据权利要求2所述的抗体，其中所述修饰是在κ轻链中。6.根据权利要求2所述的抗体，其中所述替代序列包括三肽
‑
VLQ
‑
。7.一种式(IV)的缀合物其中Ab是全长抗体，所述全长抗体具有选自以下的替代序列：(i)用SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸替代重链的EU 131至135处的氨基酸；(ii)用SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸替代重链的EU 160至164处的氨基酸；(iii)用SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或NO:20的氨基酸替代重链的EU 175至177处的氨基酸；(iv)用SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的氨基酸替代重链的EU 190至196处的氨基酸；(v)用SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ NO:28的氨基酸替代重链的EU 264至269处的氨基酸；(vi)用SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸替代重链的EU 280至
284处的氨基酸；(vii)用SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ Id NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:103的氨基酸替代重链的EU 292至297处的氨基酸；(viii)用SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:50的氨基酸替代重链的EU 314至319处的氨基酸；(ix)用SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53的氨基酸替代重链的EU 330至331处的氨基酸；(x)用SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:55的氨基酸替代重链的EU358至362处的氨基酸；(xi)用SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64的氨基酸替代重链的EU 384至402处的氨基酸；(xii)用SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:69的氨基酸替代重链的EU 414至419处的氨基酸；(xiii)用SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的氨基酸替代轻链的EU 122至126处的氨基酸；(xiv)用SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:75的氨基酸替代轻链的EU 152至155处的氨基酸；(xv)用SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82的氨基酸替代轻链的EU 167至170处的氨基酸；(xvi)用SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:87的氨基酸替代轻链的EU 182至190处的氨基酸；以及(xvii)用SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SSEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:96的氨基酸替代轻链的EU 199至204处的氨基酸；L是经由与所述替代序列中的谷氨酰胺的酰胺键而与Ab键合的接头部分；并且D选自蛋白质、放射性同位素、测定剂和治疗剂。8.根据权利要求7所述的缀合物，其中D是治疗剂。9.根据权利要求7所述的缀合物，其中D是TLR3、TLR7、TLR9、STING、NLRP3或RIG
‑
I激动剂。10.根据权利要求7所述的缀合物，其中L是其中T是自我牺牲基团；
t是0或1；AA
a
和每个AA
b
独立地选自丙氨酸、β
‑
丙氨酸、γ
‑
氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ
‑
羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；p是1、2、3或4；q是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且r是1、2、3、4或5。11.根据权利要求7所述的缀合物，其中所述抗体包含选自以下的修饰：(I)用SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸替代重链的EU 131至135处的氨基酸；(II)用SEQ ID NO:18的氨基酸替代重链的EU 175至177处的氨基酸；(III)用SEQ ID NO:22的氨基酸替代重链的EU 190至196处的氨基酸；(IV)用SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的氨基酸替代重链的EU 264至269处的氨基酸；(V)用SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SSEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:103的氨基酸替代重链的EU 292至297处的氨基酸；(VI)用SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:53的氨基酸替代重链的EU 330至331处的氨基酸；(VII)用SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:63的氨基酸替代重链的EU 384至402处的氨基酸；(VIII)用SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68的氨基酸替代重链的EU 414至419处的氨基酸；(IX)用SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:75的氨基酸替代轻链的EU 152至155处的氨基酸；(X)用SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:82的氨基酸替代轻链的EU 167至170处的氨基酸；以及(XI)用SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:94的氨基酸替代轻链的EU 199至204处的氨基酸。12.一种制备抗体缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，将全长抗体与包含伯胺和选自蛋白质、放射性同位素、测定剂和治疗剂的部分的胺供体化合物混合；具有替代序列的所述抗体选自：(i)用SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸替代重链的EU 131至135处的氨基酸；(ii)用SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸替代重链的EU 160至164处的氨基酸；(iii)用SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或NO:20的氨基酸替代重链的EU 175至177处的氨基酸；(iv)用SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的氨基酸替代重链的EU 190至196处的氨基酸；
(v)用SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ NO:28的氨基酸替代重链的EU 264至269处的氨基酸；(vi)用SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸替代重链的EU 280至284处的氨基酸；(vii)用SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ Id NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：百时美施贵宝公司，
类型：发明
国别省市：