【技术实现步骤摘要】
BVDV高特异性纳米抗体及其制备方法及应用
[0001]本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及抗BVDV重要功能蛋白蛋白纳米抗体的制备方法与应用，首先表达并纯化获得BVDV
‑
NS5A蛋白，使用BVDV灭活苗对羊驼进行免疫，分离淋巴细胞及血清，通过构纳米抗体噬菌体展示文库，使用BVDV
‑
E0、E2、NS5A、NS3四种功能蛋白筛选特异性纳米抗体，ELISA检测其反应原性，并对特异性良好的纳米抗体进行表达和纯化，运用Wb验证纳米抗体的特异性。
技术介绍
[0002]牛病毒性腹泻/粘膜病(Bovine Viral Diarrhea
‑
mucosal disease,BVD
‑
MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的传染病。各种年龄的牛都易感染、以犊牛易感性最高。传染源主要是病畜的分泌物、排泄物、血液和脾脏等，传播方式为直接接触或间接接触方式两种。患牛表现为发病急，体温突然升高至40～42℃，食欲...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种抗BVDV高特异性纳米抗体，其特征在于：氨基酸序列为<210>1、<210>2或<210>3之一。2.一种抗BVDV高特异性纳米抗体的制备方法，其特征在于：至少包含如下步骤：
①
羊驼的免疫并获得VHH基因使用BVDV灭活苗对羊驼进行免疫，分别在第0d、21d、49d、以及70d使用抗凝管(EDTA)采集全血，分离外周血淋巴细胞及血清；提取外周血淋巴细胞的RNA，反转录成cDNA，通过参考文献合成巢式引物进行巢式PCR扩增纳米抗体目的基因，琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，目的片段在400bp；
②
重组载体pCANTAB5E+VHH的构建取琼脂糖凝胶电泳后回收纯化的目的片段和冻存的质粒pCANTAB5E，用限制性内切酶Sfi I和Not I进行酶切；将酶切后的VHH目的片段与pCANTAB5E在200μL的无菌EP管中进行连接，配制重组载体pCANTAB5E+VHH；
③
连接产物的转化及文库鉴定连接好的重组载体pCANTAB5E+VHH转入到TG1感受态细胞中，将转化后的菌涂布于LB
‑
AMP固体培养基，放入培养箱37℃过夜培养；从转化后的培养板上随机挑取96个单克隆菌落做菌液PCR，并且对PCR产物进行鉴定目的片段插入的阳性率，并计算文库库容，得到最终得到库容为1.02
×
107CFU/mL的VHH文库；向平板中加入1mL LB
‑
AMP液体培养基，用无菌的细胞刮刀收集菌落，取20μL接种于20mL2
×
YT/AMP培养基中，放入摇床37℃，200rpm/min，培养至对数生长期，D
600nm
值在0.8
‑
1.0；加入100μL M13K07辅助噬菌体，轻轻混匀，37℃静置30min；2800g室温离心10min，弃上清，菌体用200mL 2
×
YT/AMP培养基重悬，放入摇床37℃，200rpm/min培养12h；放入离心机，4℃，12000g离心15min，收集上清，加入0.1mL预冷的PEG/NaCl，上下颠倒混匀，冰上静置2h；放入离心机，4℃，10 000g离心10min，弃上清，用1mL PBS重悬噬菌体沉淀，4℃摇床孵育过夜，使噬菌体充分溶解；取保存的救援噬菌体用2
×
YT按照10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4……
10
‑
16
梯度稀释，以1:1的比例加入对数生长期的TG1，室温孵育5
‑
10min；吸取孵育后的混合液100μL，用平板涂布法均匀涂布于LB
‑
AMP固体培养基上；37℃过夜培养；次日对板上单克隆计数，并计算救援噬菌体滴度；经M13K07噬菌体救援建立纳米抗体噬菌体展示文库容量为1.68
×
10
16
CFU/mL；
④
特异性纳米抗体淘选以E0、E2、NS5A、NS3四个蛋白为包被抗原进行特异性纳米抗体淘选，将蛋白E0、E2、NS5A、NS3用包被液稀释至100μg/mL，每个蛋白包被16个孔(阴性对照用PBS代替抗原蛋白)；弃去包被液，加入200μL浓度为5％的脱脂奶粉，放入温箱，37℃封闭2h，用PBS
’
T洗涤4次，取救援后的噬菌体溶液，用2％的脱脂奶粉稀释105倍，每孔加入100μL，37℃孵育2h；弃去噬菌体样品，用PBS
’
T和PBS各洗涤5次，每孔加入100μL新鲜配制的0.1M的三乙胺，室温孵育10min，迅速用等体积PH为7.4的1M Tris
‑
HCl中和，洗脱噬菌体浓度测定，取400μL洗脱液，感染4mL对数生长期的TG1，轻轻混匀后，37℃孵育30min，加入16mL 2
×
YT
‑
AMP液体培养基，放于摇床37℃，200rpm/min培养至对数生长期，D
600nm
值在0.6
‑
0.8之间；向到达对数生长期的培养液中加入20μL M13K07辅助噬菌体，轻轻混匀后，放于37℃孵育1h，2800g离心10min，弃上清；菌体用2
×
YT
‑
AMP液体培养基重悬菌体，放入摇床37℃，220rpm/min培养14h，后进行噬菌体粒子浓缩纯化；重复三次，完成三轮淘选；
⑤
、重组纳米抗体的诱导表达及粗提物获取分别取E0、E2、NS5A、NS3第三轮筛选后洗脱得到的噬菌体，用2
×
YT稀释度为108的样品，分别取100μL加入等体积对数生长期的TG1，混匀，37℃静置15min；将感染后的TG1涂布于LB
‑
AMP固体培养基，放入温箱，37℃培养8h；每个蛋白随机挑取...
【专利技术属性】
技术研发人员：盛金良，杨艳，陈创夫，肖盛中，李岩，周子恒，李玉豪，宋雯妍，郑婷，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：
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