用于纯化藻蓝蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于纯化通过发酵微藻类产生的特别是由嗜硫原始红藻产生的藻蓝蛋白的新方法，所述方法包括糖原的酶降解。所述方法包括糖原的酶降解。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于纯化藻蓝蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及一种用于纯化通过发酵微藻类产生的特别是由嗜硫原始红藻(Galdieria sulphuraria)产生的藻蓝蛋白的新方法，所述方法包括糖原的酶降解。

技术介绍

[0002]文献中已经描述了通过硫酸铵沉淀从嗜硫原始红藻和螺旋藻属(Spirulina)中提取的藻胆蛋白的纯化(Moon等人,2015；Cruz de Jes
ú
s等人,2006)，但是很难在工业规模上应用，因为它需要大量的硫酸铵，这带来了再处理硫酸铵和上清液方面的重大问题。
[0003]为了获得纯度水平而描述的其他纯化方法(诸如色谱方法)实施起来非常昂贵。
[0004]藻蓝蛋白提取方法通常在于沉淀存在于来自微藻类发酵的水性粗提取物中的除藻蓝蛋白以外的有机物质以将藻蓝蛋白保存在上清液中，将其进行过滤然后沉淀藻蓝蛋白。然而，一些有机化合物，特别是复合多糖(诸如糖原)对这种沉淀仍不敏感。
[0005]在工业藻蓝蛋白纯化方法中，可以使用过滤(超滤)步骤去除水，以便浓缩藻蓝蛋白并且去除小于所使用的过滤器的截止阈值的小分子(蛋白质、离子、有机酸等)，以便获得最纯的藻蓝蛋白。然而，过滤器的截止阈值低于糖原的大小，所以后者没有被去除并且增加了渗余物的粘度，限制了过滤的实施及其最佳参数的维持。已经使用来自嗜硫原始红藻的纯化的糖原证明了糖原的浓度依赖性粘度效应(Martinez
‑
Garcia等人,2017)。
[0006]此外，获得的纯化的藻蓝蛋白保留了高水平的这些糖，这可能会改变纯化的产物的特性，特别是着色力，从而需要更高量的藻蓝蛋白来获得相同的视觉效果。这些残余的多糖充当了增加藻蓝蛋白制造成本的填充剂，并且可能限制所得的藻蓝蛋白例如在制备具有低糖含量的食料中的商业用途。残余的多糖的存在可能限制产品用于制备具有低糖含量的食品的用途，从而导致去除这些糖的额外成本。
[0007]糖原是一种如果旨在从通常的糖降解条件中保存藻蓝蛋白，则很难去除的复合糖。糖原是由通过α(1
‑
6)连接来分支的α(1
‑
4)葡萄糖苷链组成的支链多葡萄糖苷。
[0008]用于细胞裂解的酶的使用在用于从微生物培养物中提取藻蓝蛋白的方法中是已知的(CN 106749633、CN102433015和CN1117973)。此细胞裂解步骤(打破细胞壁以释放藻蓝蛋白，然后提取培养基中释放的藻蓝蛋白)对与藻蓝蛋白一起释放并且与藻蓝蛋白一起提取的糖原无显著作用。
[0009]可能实现糖原的酶降解。然而，这种多糖是对可以降解它的酶具有部分抗性的聚合物。如通过Martinez
‑
Garcia等人所示，由于特别大量的α1
‑
6葡萄糖苷分支连接，酶(诸如β
‑
淀粉酶(α1
‑
4葡萄糖苷酶))的使用是不合适的。这些作者示出了胰腺α
‑
淀粉酶(α1
‑
4葡萄糖苷酶)对糖原的相对限制的活性。还原糖测量(代表消解水平)保持较低水平并且迅速饱和。如通过Martinez
‑
Garcia等人或Shimonaga等人的工作所示，使用具有α1
‑
6葡萄糖苷酶活性的酶(异淀粉酶、普鲁兰酶)来将糖原脱支是可能的。但是，长消解时间(24至48小时)后，释放葡萄糖聚合物的消解是不完全的。
[0010]现有技术中报道的这些糖原消解实验没有考虑藻蓝蛋白保存的问题，即使所使用
的酶可影响藻蓝蛋白的完整性，从而改变其着色和抗氧化特性。
[0011]目的是通过降低最终产品中残余的糖含量，特别是残余的糖原含量，从定性的角度和从工业和经济的角度来改善用于纯化从生物质中提取的藻蓝蛋白、同时保留藻蓝蛋白特性的方法。

技术实现思路

[0012]根据本专利技术的方法在于对藻蓝蛋白溶液进行酶处理，以用适用于在基本上不降解存在的藻蓝蛋白的温度和pH条件下降解糖原的酶(即在低于6的pH和低于40℃的反应温度下具有活性的酶，诸如葡糖淀粉酶、果胶酶和普鲁兰酶及其混合物)降低糖原含量。
[0013]根据本专利技术的方法特别适用于纯化由嗜硫原始红藻产生的耐酸藻胆蛋白，在低于6(有利地为约4)的pH下进行酶反应。
[0014]本专利技术还涉及一种藻蓝蛋白提取物，其糖原/藻蓝蛋白比率(以干重计)小于6，有利地小于4，优选小于3，更优选小于2.5，甚至更优选小于1。
附图说明
[0015]图1表示在不同酶浓度下对于pH＝4消解，藻蓝蛋白随时间的损失曲线(％)。
[0016]图2表示在不同酶浓度下对于pH＝7消解，藻蓝蛋白随时间的损失曲线(％)。
[0017]图3表示在不同酶浓度下对于pH＝4消解，在糖原消解后葡萄糖释放随时间的曲线。
[0018]图4表示在不同酶浓度下对于pH＝7消解，在糖原消解后葡萄糖释放随时间的曲线。
[0019]图5表示在用和不用酶消解的情况下，渗透物通量随着过滤藻蓝蛋白提取物(C
‑
PC)的时间的变化。
[0020]图6表示对于不同的酶在pH＝4下糖原消解后的曲线。
[0021]图7表示对于不同的酶在pH＝7下糖原消解后的曲线。
具体实施方式
[0022]本专利技术涉及一种从包含一种或多种藻蓝蛋白和糖原的溶液中纯化藻蓝蛋白的方法，所述方法包括用适用于在基本上不降解存在的藻蓝蛋白的温度和pH条件下降解糖原的酶进行酶降解糖原的步骤和从糖原降解产物中分离藻蓝蛋白的步骤。
[0023]根据本专利技术的方法特别适用于纯化从产生藻蓝蛋白的还产生糖原的微生物培养物中提取的藻蓝蛋白溶液，特别是在工业生产藻蓝蛋白的方法的背景下，所述工业生产藻蓝蛋白的方法包括培养微生物，然后回收产生的生物质以提取藻蓝蛋白，以及从此生物质中回收藻蓝蛋白。
[0024]此方法特别适用于由产生高水平糖原的微生物产生的藻蓝蛋白，特别用于从基于总干物质包含多于10％糖原的生物质中提取和纯化藻蓝蛋白。
[0025]产生藻蓝蛋白的微生物是熟知的，特别是Cyanidiales目的藻类(或微藻类)。Cyanidiales目包括Cyanidiaceae科或Galdieriaceae科，它们本身细分为Cyanidioschyzon、Cyanidium或Galdieria属，除了其他物种外属于这些属的有
Cyanidioschyzon merolae 10D、Cyanidioschyzon merolae DBV201、Cyanidium caldarium、Cyanidium daedalumm、Cyanidium maximum、Cyanidium partitum、Cyanidium rumpens、Galdieria daedala、Galdieria maxima、Galdieria partita和嗜硫原始红藻。可以特别提及的是嗜硫原始红藻(也称为Cyanidium cal本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从包含一种或多种藻蓝蛋白和糖原的溶液中纯化藻蓝蛋白的方法，所述方法的特征在于它包括(i)用适用于在低于6的pH和低于40℃的反应温度下降解糖原的酶进行酶降解所述糖原的步骤和(ii)从糖原降解产物中分离藻蓝蛋白的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述温度低于30℃和/或所述pH小于或等于5。3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其特征在于所述酶具有α1
‑
4葡萄糖苷酶或聚半乳糖醛酸酶活性。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述酶是果胶酶。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于所述酶是一种酶混合物，所述酶混合物除具有α1
‑
4葡萄糖苷酶或聚半乳糖醛酸酶活性的酶外，还包含具有α1
‑
6葡萄糖苷酶活性的酶。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述具有α1
‑
6葡萄糖苷酶活性的酶是普鲁兰酶。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述酶混合物包含果胶酶和普鲁兰酶。8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于所述酶具有α1
‑
4葡萄糖苷酶或聚半乳糖醛酸酶活性以及α1
‑
6葡萄糖苷酶活性。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述酶是葡糖淀粉酶。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于所述包含一种或多种藻蓝蛋白和糖原的溶液是在产生藻蓝蛋白的微生物生物质的细胞裂解后获得的粗悬浮液。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于所述包含一种或多种藻蓝蛋白和糖原的溶液是在产生藻蓝蛋白的微生物生物质的细胞裂解后获得的粗悬浮液本身的过滤后获得的粗溶液。12.一种生产微生物来源的藻蓝蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(a)如上所述，在培养条件下培养产生藻蓝蛋白的微生物以产生包含多于30g/L干物质和基于干物质的至少4％藻蓝蛋白的发酵汁，(b)细胞裂解以释放产生的藻蓝蛋白和糖原以获得如上所定义的粗悬浮液，(c)分离所述粗悬浮液以回收包含藻蓝蛋白和糖原的粗溶液，并且然后任选地(d)将藻蓝蛋白从所述粗溶液中分离，然后任选地(e)对分离的藻蓝蛋白进行纯化，其特征在于，用适用于在低于6的pH和低于40℃的反应温度下降解糖原的酶进行所述糖原的酶裂解步骤，所述酶裂解是对在(b)中获得的粗悬浮液和/或在(c)中获得的粗溶液进行的。13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述温度低于30℃和/或所述pH小于或等于5。14.根据权利要求12或13中任一项所述的方法，其特征在于所述酶具有α1
‑
4葡萄糖苷酶或聚半乳糖醛酸酶活性。15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述酶是果胶酶。16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其特征在于所述酶是一种酶混合物，所述酶混...

【专利技术属性】
技术研发人员：O，
申请(专利权)人：费尔曼塔格公司，
类型：发明
国别省市：