抗5-氟尿嘧啶单克隆抗体的制备方法、5-氟尿嘧啶的酶联免疫检测方法技术

本发明专利技术公开了一种抗5

【技术实现步骤摘要】
抗5
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氟尿嘧啶单克隆抗体的制备方法、5
‑
氟尿嘧啶的酶联免疫检测方法


[0001]本专利技术涉及免疫学检测分析
，具体涉及一种抗5
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氟尿嘧啶单克隆抗体的制备方法、5
‑
氟尿嘧啶的酶联免疫检测方法。

技术介绍

[0002]癌症是当今对人们的身体健康的最大威胁，且近十几年来发病死亡均呈持续上升态势。5
‑
氟尿嘧啶(5
‑
Fluorouracil,5
‑
FU)是目前临床常用的抗代谢类抗癌药物之一，可用于治疗胃肠道肿瘤、消化道肿瘤、乳腺肿瘤等多种肿瘤，主要通过影响DNA和RNA的生物合成。其进入体内以后，由肝脏肝酶作用而转化成为氟尿嘧啶脱氧核苷，后者与肿瘤细胞的细胞核中的DNA相互结合、作用而阻断肿瘤细胞的分裂、增殖，从而达到杀伤恶性肿瘤细胞的作用。
[0003]但是，5
‑
FU存在治疗指数低、半衰期短、吸收不稳定等特点，导致必须长时间静脉给药才能维持一定的血药浓度，且临床有效剂量与中毒剂量十分相近，易发生不良反应如食欲不振、恶心、呕吐、胃炎、腹痛及腹泻，严重者有血性腹泻或便血，同时会产生不同程度的骨髓抑制，可导致白细胞及血小板减少等。因此，在癌症治疗过程中迫切需要对患者血液中5
‑
FU的浓度进行监测，根据5
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FU血药浓度来制订个体化给药方案，调整5
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FU用药剂量、给药方式等，使之维持在有效的浓度范围，以达到进一步提高疗效及减少不良反应的目的。
[0004]目前常用的检测血液中5
‑
氟尿嘧啶含量的方法有气相色谱法(GC)、气质联用法(GC
‑
MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液
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质联用法(LC
‑
MS，LC
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MS/MS)等，但是这些方法存在仪器昂贵、样品预处理复杂、检测成本高、无法满足大批量样本快速监测的需要等缺陷。
[0005]在抗原与抗体之间特异性反应基础上建立的免疫分析方法具有灵敏度高、特异性强、检测速度快、操作简便等特点，已广泛用于临床、生化、药物、食品和环境分析领域中。目前，临床上用于检测5
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FU血药浓度的免疫分析方法只有美国Saladax生物医学公司研发的纳米增强免疫浊度法试剂盒(My5
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FUTM)。由于5
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FU分子量小(M.W.130)，结构简单(一个嘧啶环)，不具有免疫原性，为半抗原，使得试剂盒生产所必需的抗5
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FU的单克隆抗体的制备非常困难，因而该试剂盒价格昂贵，检测费用高。因而，如何制备出高灵敏、高特异的抗5
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FU的抗体，并开发出灵敏、快速、准确、方便、高效且检测费用低的5
‑
FU血药浓度检测方法仍是在抗癌工作中所面临的巨大挑战。

技术实现思路

[0006]为克服上述缺点，本专利技术的目的在于提供一种抗5
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氟尿嘧啶单克隆抗体的制备方法和5
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氟尿嘧啶的酶联免疫检测方法，本专利技术的单克隆抗体的制备方法保持了5
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FU原有的分子结构，因而能够被动物的免疫细胞有效识别，利用本专利技术的检测方法对血液中的5
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FU含量的检测速度快，且结果准确，与现有的色谱检测结果一致度高。
[0007]本专利技术的抗5
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氟尿嘧啶单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
[0008]11、利用第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物作为免疫原对实验动物进行免疫；
[0009]12、利用间接ELISA法筛选得到阳性杂交瘤细胞，在ELISA中的包被抗原为第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物；
[0010]13、单克隆抗体的生产：利用步骤12的阳性杂交瘤细胞接种于实验动物体内，收集得到单克隆抗体，
[0011]所述第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物与所述第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物为分别将5
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氟尿嘧啶连接不同碳链长度的连接臂且端基为羧基的5
‑
氟尿嘧啶修饰物，与所述第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物连接的连接臂的碳链长度小于与所述第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物连接的连接臂的碳链长度。
[0012]进一步的，所述第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物为连接臂为2个碳原子且端基为羧基的5
‑
氟尿嘧啶修饰物，其制备反应式如下：
[0013][0014]所述第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物为一种连接臂为3个碳原子且端基为羧基的5
‑
氟尿嘧啶修饰物，其制备反应式如下：
[0015][0016]进一步的，所述免疫原按照如下方法制备：将5
‑
氟尿嘧啶
‑1‑
丙酸溶于二甲基甲酰胺中，再分别加入N
‑
羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺，4℃下搅拌过夜后离心，将上清液逐滴加到含牛血清白蛋白的缓冲液溶液中，搅拌后离心分离，取上层清液，透析后的溶液冷冻干燥，置冰箱中存放，由此制备得到5
‑
FUPA
‑
BSA连接物作为免疫原；
[0017]所述包被抗原按照如下方法制备：
[0018]将5
‑
氟尿嘧啶
‑1‑
乙酸溶于DMF中，再分别加入NHS和DCC，4℃下搅拌过夜后离心，取上清液逐滴加到含卵清白蛋白的PBS溶液中，搅拌后离心分离，取上层清液，透析数天，溶液冷冻干燥，置冰箱中存放，由此制备得到5
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FUAA
‑
OVA连接物作为包被抗原。
[0019]本专利技术还提供了一种5
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氟尿嘧啶的酶联免疫检测方法，其利用前述的方法制备得到的抗5
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氟尿嘧啶单克隆抗体，通过间接竞争ELISA对样品中的5
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氟尿嘧啶进行检测，ELISA具体包括如下步骤：
[0020]21、用第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物包板后封阻；
[0021]22、加入样品溶液和单克隆抗体溶液；
[0022]23、加入酶标二抗；
[0023]24、加入底物液显色；
[0024]25、用酶标仪测定吸光度值。
[0025]进一步的，还包括对样品中的5
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氟尿嘧啶进行层析处理的步骤，利用权利要求1所述的方法制备得到的抗5
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氟尿嘧啶的单抗制备免疫层析柱，并利用免疫层析柱对样品中5
‑
氟尿嘧啶进行分离。
[0026]更进一步的，本专利技术的免疫层析柱的制备方法如下：
[0027]31、利用溴化氰活化的Sepharose
‑
4B凝胶经洗涤后，加入到含抗5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗5
‑
氟尿嘧啶单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：11、利用第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物作为免疫原对实验动物进行免疫；12、利用间接ELISA法筛选得到阳性杂交瘤细胞，在ELISA中的包被抗原为第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物；13、单克隆抗体的生产：利用步骤12的阳性杂交瘤细胞接种于实验动物体内，收集得到单克隆抗体，所述第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物与所述第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物为分别将5
‑
氟尿嘧啶连接不同碳链长度的连接臂且端基为羧基的5
‑
氟尿嘧啶修饰物，与所述第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物连接的连接臂的碳链长度小于与所述第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物连接的连接臂的碳链长度。2.根据权利要求1所述的抗5
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氟尿嘧啶单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述第一5
‑
氟尿嘧啶修饰物为连接臂为2个碳原子且端基为羧基的5
‑
氟尿嘧啶修饰物，其制备反应式如下：所述第二5
‑
氟尿嘧啶修饰物为一种连接臂为3个碳原子且端基为羧基的5
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氟尿嘧啶修饰物，其制备反应式如下：3.根据权利要求1所述的抗5
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氟尿嘧啶单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫原按照如下方法制备：将5
‑
氟尿嘧啶
‑1‑
丙酸溶于二甲基甲酰胺中，再分别加入N
‑
羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺，4℃下搅拌过夜后离心，将上清液逐滴加到含牛血清白蛋白的缓冲液溶液中，搅拌后离心分离，取上层清液，透析后的溶液冷冻干燥，置冰箱中存放，由此制备得到5
‑
FUPA
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BSA连接物作为免疫原；所述包被抗原按照如下方法制备：将5
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氟尿嘧啶
‑1‑
乙酸溶于DMF中，再分别...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵林川，姚金美，王跃，邓礼良，
申请(专利权)人：苏州科铭生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：