一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其解决现有壳聚糖化学法易污染环境、酶法反应时间长、物理法产率不佳的问题，其包括以下步骤：1）发酵菌液的制备；2）鱿鱼扇形骨发酵；3）壳聚糖制备；4）纯化。本发明专利技术以鱿鱼扇形骨为原料，通过丝状真菌菌体内甲壳素分解酶的释放，并应用于鱿鱼扇形骨初步降解，发酵产物经氧化进一步降解，并联合超临界流体除杂，获得水溶性、生物相容性良好的产品。本发明专利技术工艺采用发酵和氧化降解耦合技术，实现了壳聚糖清洁制备，具有工艺流程简单高效，反应条件温和，易控制，利于大规模推广生产。产。

【技术实现步骤摘要】
一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法


[0001]本专利技术涉及壳质多糖的制备，尤其是一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法。

技术介绍

[0002]据文献报道，水溶性壳聚糖由甲壳素脱乙酰法、壳聚糖接枝法和壳聚糖解聚法。前两种方法过程复杂、分解程度不可控，最主要需要消耗大量酸碱。壳聚糖解聚法主要有化学法、物理法和酶法，其中化学法易造成环境污染，酶法反应时间长，杂质多，且成熟技术报道少，物理法需采用专门的设备，降解产物的分子量较高，产率不佳，目前还处于实验室研究阶段。
[0003]近年来，随着壳聚糖功能的不断开发，市场需求日益增大，促进产业的发展，但现有生产工艺都存在程度不同的缺陷或不足，建立一种生产速度快，且环保、高效的水溶性壳聚糖制备方法亟需解决。

技术实现思路

[0004]为了克服现有壳聚糖化学法易污染环境、酶法反应时间长、物理法产率不佳的不足，本专利技术的目的在于提供一种工艺流程简单高效、反应条件温和的真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法。该制备方法是以鱿鱼扇形骨为原料，通过丝状真菌菌体内甲壳素分解酶的释放，并应用于鱿鱼扇形骨初步降解，发酵产物经氧化进一步降解，并联合超临界流体除杂，获得水溶性、生物相容性良好的产品。
[0005]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其特征在于，其经过以下工艺步骤：1）发酵菌液的制备取丝状真菌进行平板培养，挑取单菌落，用斜面划线法纯化；配制液体培养基，进行二级菌种培育，在温度25
‑
40℃、150
‑
180r/min振荡培养1
‑
2天，离心取沉淀，用纯净水进行清洗，冻干，超微粉碎后备用；2）鱿鱼扇形骨发酵a.取鱿鱼扇形骨，用清水冲洗除杂，粉碎机粉碎；b.取步骤a中得到的鱿鱼扇形骨粉，加入步骤1）中得到的超微粉碎菌体，加入纯净水，在温度30℃
‑
37℃、pH6
‑
7、120
‑
150r/min振荡恒温培养2
‑
3天；发酵完成后，加热至90
‑
95℃并恒温20
‑
30min，离心取上清液；3）壳聚糖制备将步骤b）中获得的上清液中加入双氧水，加热至35
‑
40℃，恒温6
‑
8h，离心取上清液，加入乙醇，离心取沉淀，纯净水冲洗，即得壳聚糖；4）纯化将步骤3）中得到的粗壳聚糖真空干燥，再将干燥的粗壳聚糖放入超临界二氧化碳
萃取器中处理2
‑
5h，萃取完成后残留物料，即为壳聚糖。
[0006]作为优选，在步骤1）中，所述的培养基为LB培养基。
[0007]作为优选，在步骤1）中，所述的丝状真菌为黑曲霉、雅致毛霉、米根霉、蓝色犁头霉中的一种或两种，超微粉碎获得的菌粉粒径为200
‑
500nm。
[0008]作为优选，在步骤2）b中，所述的鱿鱼扇形骨粉与菌粉重量比为1
‑
5:1，添加的纯净水为鱿鱼扇形骨粉与菌粉总重的10
‑
15倍。
[0009]作为优选，在步骤3）中，所述的双氧水的浓度为30
‑
35%，双氧水的加入量为步骤b）中获得的上清液重量的25
‑
30%。
[0010]作为优选，在步骤4）中，所述的超临界二氧化碳的处理条件为：压力15
‑
20MPa、温度20
‑
30℃、二氧化碳流速10
‑
15 kg/h、时间10
‑
20min。
[0011]作为优选，在步骤2）b中，发酵前还加入了3
‑
5%的矿物溶解菌。
[0012]作为优选，在步骤2）b中，所述的矿物溶解菌由乳酸杆菌、双球菌、氧化亚铁硫杆菌、多黏芽孢杆菌、好氧假单胞菌中的两种菌组成，其质量比为1:1。
[0013]本专利技术有益效果：(1)本专利技术采用双氧水可控技术，对鱿鱼扇形骨进行物理处理，同时利用其产生的高能释放，对甲壳素改性，产生水溶性甲壳素；(2)本专利技术采用生物加物理方式，克服了目前甲壳素应用的酸碱工艺污染环境的问题，为鱿鱼扇形骨的进一步深加工应用创造了条件；(3)本专利技术制备的产物均匀，无杂质，克服了酸碱分解不可控，分子量小的问题，赋予壳聚糖良好的应用性状；(4)本专利技术采用丝状真菌和矿物溶解菌协同制备水溶性壳聚糖，克服了鱿鱼扇形骨外壳成分交织叠积形成的致密壳质
‑
蛋白有机结构阻碍甲壳素分解，温和反应实现了酸碱激烈反应的技术效果；(5) 本专利技术工艺采用发酵和氧化降解耦合技术，实现了壳聚糖清洁制备，具有工艺流程简单高效，反应条件温和，易控制，利于大规模推广生产。
具体实施方式
[0014]下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细描述，所述的实施案例有助于对本专利技术的理解和实施，并非构成对本专利技术的限制。本专利技术的保护范围并不以具体实施方式为限，而是由权利要求加以限定。
[0015]实施例1一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其经过以下工艺步骤：1）发酵菌液的制备取丝状真菌进行平板培养，挑取单菌落，用斜面划线法纯化；配制液体培养基，进行二级菌种培育，在温度35℃、160r/min振荡培养1.8天，离心取沉淀，用纯净水进行清洗，冻干，超微粉碎后备用；所述的培养基为LB培养基，所述的丝状真菌为黑曲霉、蓝色犁头霉两种，超微粉碎获得的菌粉粒径为350nm；2）鱿鱼扇形骨发酵a.取鱿鱼扇形骨，用清水冲洗除杂，粉碎机粉碎；
b.取步骤a中鱿鱼扇形骨粉，加入步骤1）中得到的超微粉碎菌体，加入纯净水，在温度37℃、pH6、140r/min振荡恒温培养2.5天；发酵完成后，加热至93℃并恒温25min，离心取上清液；其中，鱿鱼扇形骨粉与菌粉重量比为4:1，添加的纯净水为鱿鱼扇形骨粉与菌粉总重的12倍；发酵前还加入了4%的矿物溶解菌，矿物溶解菌由乳酸杆菌、双球菌、氧化亚铁硫杆菌、多黏芽孢杆菌、好氧假单胞菌中的两种菌组成，其质量比为1:1；3）壳聚糖制备步骤b）中获得的上清液中加入双氧水，加热至38℃，恒温6.5h，离心取上清液，加入乙醇，离心取沉淀，纯净水冲洗即得壳聚糖；其中，所述的双氧水的浓度为33%，双氧水的加入量为步骤b）中获得的上清液重量的26%；4）纯化将步骤3）中得到的粗壳聚糖真空干燥，再将干燥的粗壳聚糖放入超临界二氧化碳萃取器中处理3h，萃取完成后残留物料即为壳聚糖；其中，所述的超临界二氧化碳处理条件为：压力17MPa、温度25℃、二氧化碳流速12kg/h、时间15min。
[0016]实施例2一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其经过以下工艺步骤：1）发酵菌液的制备取丝状真菌进行平板培养，挑取单菌落，用斜面划线法纯化；配制液体培养基，进行二级菌种培育，在温度25℃、150r/min振荡培养1天，离心取沉淀，用纯净水进行清洗，冻干，超微粉碎后备用；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其特征在于，其经过以下工艺步骤：1）发酵菌液的制备取丝状真菌进行平板培养，挑取单菌落，用斜面划线法纯化；配制液体培养基，进行二级菌种培育，在温度25
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40℃、150
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180r/min振荡培养1
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2天，离心取沉淀，用纯净水进行清洗，冻干，超微粉碎后备用；2）鱿鱼扇形骨发酵a.取鱿鱼扇形骨，用清水冲洗除杂，粉碎机粉碎；b.取步骤a中得到的鱿鱼扇形骨粉，加入步骤1）中得到的超微粉碎菌体，加入纯净水，在温度30℃
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37℃、pH6
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7、120
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150r/min振荡恒温培养2
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3天；发酵完成后，加热至90
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95℃并恒温20
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30min，离心取上清液；3）壳聚糖制备将步骤b）中获得的上清液中加入双氧水，加热至35
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40℃，恒温6
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8h，离心取上清液，加入乙醇，离心取沉淀，纯净水冲洗，即得壳聚糖；4）纯化将步骤3）中得到的粗壳聚糖真空干燥，再将干燥的粗壳聚糖放入超临界二氧化碳萃取器中处理2
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5h，萃取完成后残留物料，即为壳聚糖。2.根据权利要求1所述的一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖的方法，其特征在于，在步骤1）中，所述的培养基为LB培养基。3.根据权利要求1所述的一种真菌发酵耦合氧化鱿鱼扇形骨制备壳聚糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨劲峰，吴文惠，毕进红，
申请(专利权)人：荣成万盈水产科技有限公司，
类型：发明
国别省市：