一种大口黑鲈饲喂方式的鉴别方法技术

本发明专利技术提供一种大口黑鲈饲喂方式的鉴别方法，通过提取大口黑鲈肠道微生物总DNA，以总DNA为模板，针对聚球菌属Synechococcus种群16S rDNA的DNA序列设计引物，进行PCR扩增，若扩增产物具有570bp条带，则判定饲喂过程中添加了冰鲜鱼。本发明专利技术大口黑鲈饲喂方式的鉴别方法，可以快速、简便、准确、有效地鉴别大口黑鲈的饲喂方式，且操作简单，费用低廉，准确度高，鉴别结果稳定、可靠，能够解决大口黑鲈饲喂方式鉴别难的问题。式鉴别难的问题。式鉴别难的问题。

【技术实现步骤摘要】
鲈的饲喂方式，且操作简单，费用低廉，准确度高，鉴别结果稳定、可靠，能够解决大 口黑鲈饲喂方式鉴别难的问题。
附图说明
[0012]图1为微生物物种组成分析的Ternary三元相图；
[0013]图2为本专利技术中海水冰鲜鱼饲喂体和配合饲料饲喂个体肠道菌群DNA的PCR扩 增产物电泳图。
具体实施方式
[0014]为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本申请 作进一步说明。
[0015]实施例1：
[0016]采集海水冰鲜鱼、配合饲料以及配合饲料加海水冰鲜鱼混合3种饲喂方式的大口 黑鲈各30尾，平均体重566g。三种投喂方式的大口黑鲈养殖周期为5月
‑
9月，起始放 养鱼种的平均规格为5g，每日早晚投喂两次。5月，配合饲料为浙江欣欣天恩水产饲料 有限公司的加州鲈膨化配合饲料，粗蛋白质含量≥45％，日配合饲料投喂量为放养鱼重 量的4％，6月开始日投喂量降至3.5％，7
‑
9月日投喂量比例为3％。冰鲜鱼按照配合饲 料重量的4倍投喂。配合饲料加海水冰鲜鱼混合投喂组上午投喂配合饲料，下午投喂冰 鲜鱼，投喂量与配合饲料组和冰鲜鱼组相同。冰鲜鱼采购至当地冷库，主要来自于江苏、 山东、浙江等地沿海的捕捞野杂鱼。
[0017]采集肠道微生物，取样前使用60mg/L丁香酚对大口黑鲈进行麻醉，解剖取出肠道， 用镊子去除肠道外壁多余的脂肪组织后再用生理盐水漂洗，漂洗完成后，将肠道组织剪 短放入无菌离心管，液氮中冻存。实验室里利用Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit试剂 盒提取微生物总DNA。对总DNA的浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1％ 琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；以总DNA为模板，用338F和806R为上下游引 物对16S rRNA基因的V3
‑
V4可变区进行PCR扩增。扩增体系为20μl，4μl 5
×
FastPfu 缓冲液，2μl 2.5mM dNTPs，0.8μl引物(5μM)，0.4μl FastPfu聚合酶；10ng DNA模板。 扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min， 共25个循环；最后72℃退火6min。使用2％琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行纯化，Tris
‑
HCl洗脱，2％琼脂糖电泳检测，利用Qua ntiFluorT M
‑
ST进行检测定量，根据Illumina MiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建 PE 2
×
300的文库。原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，使用FLASH软件进行 拼接，去除长度低于50bp及以下的序列、错配序列以及无法拼接的序列；使用UPARSE 软件，根据97％的相似度对序列进行OTU聚类；使用UCHIME软件剔除嵌合体；利用 RDP classifier对每条序列进行物种分类注释；
[0018]将处理的数据进行物种组成分析，Ternary三元相图，如图2和表1，发现，在属水 平上，海水冰鲜鱼、配合饲料以及配合饲料加海水冰鲜鱼混合三组中，微生物聚球菌属 Synechococcus种群特异性的出现在饲喂海水冰鲜鱼的组别中，其中海水冰鲜鱼相对含量 93.8％，配合饲料加海水冰鲜鱼混合组相对含量6.2％，而配合饲料组不含有聚球菌属 Synechococcus种群。
[0019]表1三种投喂方法下大口黑鲈肠道菌群属级组成
[0020][0021]Others包含相对含量<1％的菌属，主要包括Oceanobacillus(0.95％)、Denitratisome (0.94％)、Bacillus(0.75％)、JG30
‑
KF
‑
CM45(0.72％)和Rhizobiales_Incertae
‑
Sedis(0.63％)等菌 属。
[0022]针对海水冰鲜鱼饲喂组别特异性的肠道微生物聚球菌属Synechococcus种群16S rDNA基因的DNA序列(SEQ ID NO:3)设计一对扩增用的特异性引物，使用上述的引物对 进行PCR扩增，如果所提大口黑鲈肠道DNA能扩增出16S rDNA基因长度570bp的条带， 则证明该大口黑鲈养殖过程中有饲喂海水冰鲜鱼，如果没有条带则证明未饲喂海水冰鲜 鱼。
[0023]特异性引物和聚球菌属Synechococcus种群16S rDNA基因的DNA序列信息如下：
[0024]正向引物F:5'
‑
TAACTGACACTGAGGGACGAAA
‑
3'(SEQ ID NO:1)；
[0025]反向引物R:5'
‑
CCTGCAATCTGAACTGAGGC
‑
3'(SEQ ID NO:2)
[0026]>Synechococcus sp.16S rRNA gene(SEQ ID NO:3)
[0027]TCAGGATGAACGCTGGCGGTATGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCCTTCGG GCTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGAGAATCTGCCTTCAGGACGGGGACA ACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCCGATATGCCGAGAGGTGAAATCTTTTTTGGC CTGAAGATGAGCTCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGTGTAAGGGACCACCAAGG CGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGAGCAGCCACACTGGGACTGAGACAC GGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTCCGCAATGGGCGAAAGC CTGACGGAGCAATACCGCGTGAGGGAGGAAGGTCTTTGGATTGTAAACCTCTTTTC TCAAGGAAGAATAAATGACGGTACTTGAGGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAA GAGTCCGTAGGTGGTCATGCAAGTCTGCTGTCAAAGCCCACAGCTTAACTGTGGAT CGGCGGTGGAAACTGTGTGACTTGAGTACGGTAGGGGTAGAGGGAATTCCCAGTG TAGCGGTGAAATGCGTAGATATTGGGAAGAACACCGGTGGCGAAAGCGCTCTACT GGA
CCGTAACTGACACTGAGGGACGAAAGCTAAGGTAGCGAAAGGGATTAGATAC CCCTGTAGTCTTAGCCGTAAACGATGGATACTAGG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大口黑鲈饲喂方式的鉴别方法，其特征在于：包括以下步骤，(1)提取大口黑鲈肠道微生物总DNA；(2)以总DNA为模板，针对聚球菌属Synechococcus种群16S rDNA的DNA序列设计引物，进行PCR扩增，若扩增产物具有570bp条带，则判定饲喂过程中添加了冰鲜鱼。2.如权利要求1所述的大口黑鲈饲喂方式的鉴别方法，其特征在于：步骤(1)中所述提取，其为通过采集大口黑鲈肠道微生物，提取微生物总DNA。3.如权利要求1所述的大口黑鲈饲喂方式的鉴别方法，其特征在于：步骤(2)中，所述引物，其正向引物SEQ ID NO:1序列为5'
‑
TAACTGACACTGAGGGACGAAA
‑
3'，反向引物SEQ ID NO:2序列为5'
‑
CCTGCAATCTGAACTGAGGC
‑
3'。4.如权利要求1所述的大口黑鲈饲喂方式的鉴别方法，其特征在于：步骤(2)中，所述进行PCR扩增，其反应体系为50μL：1μL模板DNA(50ng/μL...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟立强，陈校辉，王明华，张世勇，姜虎成，
申请(专利权)人：江苏省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：