一种重组SGLT2蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种重组SGLT2蛋白及其应用，所述重组SGLT2蛋白包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明专利技术还提供了一种核酸分子、一种重组质粒、一种重组病毒、一种重组细胞以及所述重组SGLT2蛋白的制备方法。所述重组SGLT2蛋白具有良好的折叠以及翻译后加工的水平，与天然状态下的蛋白十分接近，生物活性好，稳定性高，水溶性好；所述重组SGLT2蛋白的制备方法技术成熟，成功率高，容易掌握，重组蛋白的产量高，纯化效果好，应用前景广阔。应用前景广阔。应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
一种重组SGLT2蛋白及其应用


[0001]本专利技术属于重组蛋白
，尤其涉及一种重组SGLT2蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]糖尿病是一种非常普遍的慢性代谢性疾病，主要表现症状为高血糖，是影响人类生活的重大疾病之一。葡萄糖流经肾脏时，90％以上的葡萄糖将被重吸收，回到血液循环中。在生物体内，葡萄糖必须借助于细胞膜上的葡萄糖转运蛋白才能自由通过细胞膜的脂质双分子层。
[0003]钠依赖的葡萄糖运载体(SGLTs)是一类在小肠黏膜和肾脏近曲小管中发现的转运蛋白家族，肾脏重吸收葡萄糖的过程主要由SGLTs介导，其中，SGLT1和SGLT2最为重要。SGLT1是一种高亲和力低效能的转运蛋白，且不具有葡萄糖特异性。SGLT2负责将肾小球滤过的约90％的葡萄糖重新吸收回血液中，是一种低亲和力高转运能力的葡萄糖转运蛋白。
[0004]针对SGLT2靶点的药物不仅能有效抑制肾小管重吸收葡萄糖、促进葡萄糖从尿液中排出，达到降低血糖目的，还不会增加低血糖发生的风险，可改善血压及体重。同时还有研究发现，其可以降低心血管和终末期肾脏疾病的风险，以及延缓慢性肾脏疾病的进程，具有肾脏保护作用。
[0005]选择性地抑制SGLT2蛋白活性、不依赖于胰岛素分泌的降糖途径，为糖尿病的治疗提供了一条新的途径，成为降糖药物研究的热点。因此，体外获取高纯度且稳定的SGLT2蛋白是药物筛选以及疾病机理研究等相关工作的基础。目前，SGLT2蛋白体外表达的工作中往往存在蛋白产量低、修饰程度较低、稳定性较差以及操作困难等弊端。
[0006]如何提供一种操作简单、效率高、稳定性好的SGLT2蛋白的表达以纯化方法，已成为亟待解决的问题。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种重组SGLT2蛋白及其应用，通过在SGLT2蛋白的N端添加麦芽糖结合蛋白，增加了重组蛋白的表达量和水溶性，稳定性也得以提升，且为蛋白的后续纯化提供了方便。
[0008]为达此目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种重组SGLT2蛋白，所述重组SGLT2蛋白包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
[0010]SEQ ID No.1：
[0011]ATMGMGSSHHHHHHGSSMKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGR
QTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIELEVLFQGPMEEHTEAGSAPEMGAQKALIDNPADILVIAAYFLLVIGVGLWSMCRTNRGTVGGYFLAGRSMVWWPVGASLFASNIGSGHFVGLAGTGAASGLAVAGFEWNALFVVLLLGWLFAPVYLTAGVITMPQYLRKRFGGRRIRLYLSVLSLFLYIFTKISVDMFSGAVFIQQALGWNIYASVIALLGITMIYTVTGGLAALMYTDTVQTFVILGGACILMGYAFHEVGGYSGLFDKYLGAATSLTVSEDPAVGNISSFCYRPRPDSYHLLRHPVTGDLPWPALLLGLTIVSGWYWCSDQVIVQRCLAGKSLTHIKAGCILCGYLKLTPMFLMVMPGMISRILYPDEVACVVPEVCRRVCGTEVGCSNIAYPRLVVKLMPNGLRGLMLAVMLAALMSSLASIFNSSSTLFTMDIYTRLRPRAGDRELLLVGRLWVVFIVVVSVAWLPVVQAAQGGQLFDYIQAVSSYLAPPVSAVFVLALFVPRVNEQGAFWGLIGGLLMGLARLIPEFSFGSGSCVQPSACPAFLCGVHYLYFAIVLFFCSGLLTLTVSLCTAPIPRKHLHRLVFSLRHSKEEREDLDADEQQGSSLPVQNGCPESAMEMNEPQAPAPSLFRQCLLWFCGMSRGGVGSPPPLTQEEAAAAARRLEDISEDPSWARVVNLNALLMMAVAVFLWGFYA。
[0012]本专利技术中，通过在SGLT2蛋白的N端添加麦芽糖结合蛋白(MBP)，可以减少SGLT2蛋白的降解，增加了蛋白的表达量，提高了重组蛋白的稳定性及水溶性。MBP还可以促进蛋白进行正确地折叠，体外获取的蛋白更接近其天然结构，获得的实验数据及结果更加准确。此外，MBP可以作为分子标签为蛋白的纯化提供基础，将目标蛋白与其他蛋白成分分开，获取的蛋白的纯度更高，操作更为简便，生产效率更高。
[0013]第二方面，本专利技术提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的重组SGLT2蛋白。
[0014]优选地，所述核酸分子包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
[0015]SEQ ID No.2：
[0016]gccaccatgggcatgggttcttctcaccatcaccatcaccatggttcttctatgaaaatcgaagaaggtaaactggtaatctggattaacggcgataaaggctataacggtctcgctgaagtcggtaagaaattcgagaaagataccggaattaaagtcaccgttgagcatccggataaactggaagagaaattcccacaggttgcggcaactggcgatggccctgacattatcttctgggcacacgaccgctttggtggctacgctcaatctggcctgttggctgaaatcaccccggacaaagcgttccaggacaagctgtatccgtttacctgggatgccgtacgttacaacggcaagctgattgcttacccgatcgctgttgaagcgttatcgctgatttataacaaagatctgctgccgaacccgccaaaaacctgggaagagatcccggcgctggataaagaactgaaagcgaaaggtaagagcgcgctgatgttcaacctgcaagaaccgtacttcacctggccgctgattgctgctgacgggggttatgcgttcaagtatgaaaacggcaagtacgaca本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组SGLT2蛋白，其特征在于，所述重组SGLT2蛋白包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的重组SGLT2蛋白；优选地，所述核酸分子包括SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求2所述的核酸分子。4.一种重组病毒，其特征在于，所述重组病毒由权利要求3所述的重组质粒转染受体细胞包装得到。5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求3所述的重组质粒；优选地，所述重组细胞含有权利要求4所述的重组病毒。6.一种权利要求1所述的重组SGLT2蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将核酸分子克隆入载体中，构建重组质粒；所述重组质粒转染受体细胞，构建重组病毒；所述重组病毒感染哺乳动物细胞，诱导蛋白表达，再进行纯化，得到所述重组SGLT2蛋白。7.根据权利要求6所述的重组SGLT2蛋白的制备方法，其特征在于，所述载体包括pEGBacmam载体；优选地，所述克隆后还包括转化克隆感受态细胞、鉴定阳性单克隆再进行重组的步骤；优选地，所述克隆感受态细胞包括Trans5α；优选地，所述重组的步骤包括所述阳性单克隆转化重组感受态细胞，蓝白斑筛选，得到重组质粒；优选地，所述重组感受态细胞包括DH10 Bac；优选地，所述受体细胞包括昆虫细胞sf9。8.根据权利要求6或7所述的重组SGLT2蛋白的制备方法，其特征在于，所述感染的步骤包括：哺乳动物细胞的密度为1～5
×
106细胞/mL时，加入重组病毒，培养12～24h；优选地，所述哺乳动物细胞包括HEK293S GnTI细胞；优选地，所述诱导蛋白表达的步骤包括：加入诱导剂，降温，继续培养；优选地，所述诱导剂包括丁酸钠，所述丁酸钠的终浓度为8～12mM；优选地，所述降温的温度为28～32℃；优选地，所述继续培养的时间为48～60h；优选地，所述纯化的步骤包括：离心收集细胞，使用缓冲液重悬，破碎细胞后加入蛋白提取溶液，孵育，收集上清液，直链淀粉树脂纯化蛋白，再通过尺寸排阻层析柱分离目标蛋白，检测；优选地，以质量分数计，所述缓冲液包括0.8％～1.2％不含EDTA的蛋白酶抑制剂，余量为45～55mM Tris
‑
HCl和140～160mM NaCl组成的混合溶液，所述缓冲液的pH值为7～8；优选地，以质量分数计，所述蛋白提取溶液包括0.8％～1.2％N
‑
十二烷基
‑
β
‑
D
‑
麦芽糖苷和0.08％～0.12％胆固醇半琥珀酸酯，余量为水；优选地，所述收集上清液通过离心进行，所述离心的转速为35000～50000rpm；
优选地，以质量分数计，所述直链淀粉树脂纯化使用的洗涤液...

【专利技术属性】
技术研发人员：张进，李健，张雨婷，南伟伟，万双燕，
申请(专利权)人：江西晶美瑞生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：