光倒刺鲃的雄性分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了光倒刺鲃的雄性分子标记及其应用，所述雄性分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明专利技术还提供了特异性扩增分子标记的引物。本发明专利技术从光倒刺鲃中筛选获得了雄性特异性的分子标记，根据该分子标记设计的检测引物只能在光倒刺鲃雄性个体中扩增出目的条带，从而可以用该分子标记鉴定或辅助鉴定光倒刺鲃的性别。同时还提供了一种光倒刺鲃性别鉴别的方法。通过该技术可以快速、准确、便捷地鉴定光倒刺鲃的性别，特异性为100％，且对鱼体伤害较低，为光倒刺鲃性控育种和种质资源保护、改进与可持续利用提供帮助。改进与可持续利用提供帮助。

【技术实现步骤摘要】
光倒刺鲃的雄性分子标记及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物
，具体涉及光倒刺鲃的雄性分子标记及其应用。

技术介绍

[0002]光倒刺鲃(Spinibarbus hollandi)，隶属于鲤形目，鲤科，鲃亚科，倒刺鲃属。主要分布于中国的长江以南各个水系，是一种具有较高营养和药用价值的名优经济鱼类，深受市场和养殖户喜爱。然而，自20世纪80年代以来，由于各种人为因素导致光倒刺鲃的自然种群资源急剧下降，在我国许多江河已难觅踪迹。为保护这一水产种质资源，农业部先后在广东、广西、江西、福建、湖南、安徽等省建立了10多个光倒刺鲃国家级水产种质资源保护区。
[0003]光倒刺鲃的生长呈现性别二态性，在成鱼养殖阶段，雌鱼生长比雄鱼快。因此，探索光倒刺鲃性别分化的调控机制，建立全雌或高比例雌性光倒刺鲃培育新技术对其种质资源保护和开发利用具有重要的理论和实际意义。而性别特异分子标记的开发有助于准确快速获取表型，判断性别，从而开展人工繁殖和选育等工作，也有助于在商业生产中开展性别控制育种技术研究，进而建立单性体系。如今，尚无能够成功鉴定光倒刺鲃遗传性别的分子标记的报道，因此，开发一种准确鉴定遗传雄性的分子标记在光倒刺鲃人工繁育中具有极大的生产应用价值。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种可以准确鉴定雄性光倒刺鲃的分子标记。
[0005]本专利技术所采取的技术方案是：
[0006]本专利技术的第一个方面，提供一种光倒刺鲃的雄性分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术的第二个方面，提供一种引物，扩增本专利技术第一方面所述的分子标记。
[0008]在本专利技术的一些实施方式中，所述引物为：
[0009]P20
‑
F：5
’‑
TGCAAACTGTCTGGCATTCTC
‑3’
(SEQ ID NO.2)；
[0010]P20
‑
R：5
’‑
ATCTACTGCCCTCTGTCCTTT
‑3’
(SEQ ID NO.3)。
[0011]本专利技术的第三方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本专利技术第二方面所述的引物。
[0012]本专利技术的第四方面，提供本专利技术第一方面所述分子标记或本专利技术第二方面所述引物或本专利技术第三方面所述试剂盒在用于鉴定或辅助鉴定雄性光倒刺鲃遗传性别中的应用。采用本专利技术第二个方面所述引物或本专利技术第三个方面所述试剂盒对光倒刺鲃进行检测，筛选出雄性光倒刺鲃的品种，有利于鉴定或辅助鉴定雄性光倒刺鲃遗传性别。
[0013]本专利技术的第五方面，提供本专利技术第一方面所述分子标记或本专利技术第二方面所述引物或本专利技术第三方面所述试剂盒在光倒刺鲃遗传育种中的应用。
[0014]本专利技术的第六方面，提供本专利技术第一方面所述分子标记或本专利技术第二方面所述引物或本专利技术第三方面所述试剂盒在光倒刺鲃种质资源改进中的应用。
[0015]本专利技术的第七方面，提供一种用于筛选雄性光倒刺鲃的方法，通过检测本专利技术第一方面所述分子标记，选择含有分子标记的个体。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
[0017](1)提取待检样品基因组DNA；
[0018](2)以提取得到的DNA为模板，利用本专利技术第二方面所述的引物进行PCR扩增，得到PCR产物；
[0019](3)分析电泳结果，如果含有条带，则该样品为雄性光倒刺鲃。
[0020]本专利技术的第八方面，提供一种光倒刺鲃辅助育种方法，通过本专利技术第七方面所述方法，确定待测光倒刺鲃的性别。
[0021]本专利技术的有益效果是：
[0022]本专利技术公开了一种光倒刺鲃(Spinibarbus hollandi)的雄性分子标记，所述雄性分子标记的序列为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本专利技术该提供了特异性扩增分子标记的引物，引物的核苷酸序列如P20
‑
F和P20
‑
R所示；还提供了包含上述引物的试剂盒。本专利技术从光倒刺鲃中筛选获得了雄性特异性的分子标记，根据该分子标记设计的检测引物只能在光倒刺鲃雄性个体中扩增出目的条带，从而可以用该分子标记鉴定或辅助鉴定光倒刺鲃的性别。同时还提供了一种光倒刺鲃性别鉴别的方法。通过该技术可以快速、准确、便捷地鉴定光倒刺鲃的性别，特异性为100％，且对鱼体伤害较低，为光倒刺鲃性控育种和种质资源保护、改进与可持续利用提供帮助。
附图说明
[0023]图1为实施例2中引物P20
‑
F/R的电泳检测结果。
[0024]图2为实施例3中引物对P20
‑
F/R对30个DNA雌性样品的电泳检测结果。
[0025]图3为实施例3中引物对P20
‑
F/R对30个DNA雄性样品的电泳检测结果。
具体实施方式
[0026]以下将结合实施例对本专利技术的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本专利技术的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本专利技术的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本专利技术的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本专利技术保护的范围。
[0027]实施例1测序文库构建及基因组测序
[0028](1)光倒刺鲃DNA样品
[0029]选取性成熟的光倒刺鲃，采集性腺组织，雌性18尾和雄性19尾，采用动物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，参照说明书操作步骤制备DNA样品。DNA完整性采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，紫外分光光度计测其OD值并稀释至50ng/μL。
[0030](2)测序文库构建及高通量测序
[0031]分别取3例雌鱼和3例雄鱼的DNA样品，构建插入片段大小为350bp的双末端测序文库，文库构建完成后以qPCR方法和Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Technologies,USA)进行质控。对质检合格的DNA文库采用Illumina Hiseq Novaseq6000(Illumina,USA)高通量测序平台进行测序，测序策略为PE150(Pair
‑
End 150)。分别获得雌、雄基因组测序
clean data：60,601,902,080bp和50,978,294,016bp。通过比较分析初步判定待测光倒刺鲃属于XY型性别决定机制。
[0032]在上一步骤验证结果基础上，通过批量验证雌性样品，在更大的范围验证性别特异分子标记的可靠性。从其余15份雌鱼和16份雄鱼的DNA样品中，各取等量DNA混匀成雌、雌鱼DNA混合池。通过构建插入片段大小为350bp的双末端测序文库，采用Illumina Hiseq Novaseq6000(Illumina,USA)高通量测序平台进行测序，分别为获得雌、雄鱼DNA混合池测序clean本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.光倒刺鲃的雄性分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种引物，扩增权利要求1所述的分子标记。3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于，所述引物为：P20
‑
F：5
’‑
TGCAAACTGTCTGGCATTCTC
‑3’
(SEQ ID NO.2)；P20
‑
R：5
’‑
ATCTACTGCCCTCTGTCCTTT
‑3’
(SEQ ID NO.3)。4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2或3所述的引物。5.权利要求1所述分子标记或权利要求2或3所述引物或权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：李强，李文俊，韩崇，李陇旭，易祖盛，桂林，钟良明，陈杰湖，黄靖传，
申请(专利权)人：广州大学，
类型：发明
国别省市：