一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法技术

本发明专利技术提供一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，首次以刺葡萄愈伤组织细胞为原料提取纯化可食用花色苷，依次通过刺葡萄愈伤组织细胞的获取、刺葡萄愈伤组织细胞的预处理、制备花色苷提取液、花色苷提取液过滤、花色苷提取液浓缩、花色苷浓缩液检测、花色苷纯化和洗脱、及纯化花色苷获取等步骤获取可食用花色苷。本发明专利技术具有对刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取效果好、纯度高的显著特征，提取剂采用食品级乙醇与食品级柠檬酸作为混合提取溶剂，溶剂使用量小，无有毒物质残留，具备作为安全性食用花色苷生产的条件，同时采用刺葡萄愈伤组织细胞作为天然花色苷提取材料，该材料具有周年、全天候生产的特性、产量稳定、人为可控性等特点。可控性等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法


[0001]本专利技术属于植物天然生物活性物质提取纯化
，具体涉及一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法。

技术介绍

[0002]花色苷是一种天然的食用色素，具有安全，无毒的特点。花色苷虽然广泛地存在于天然植物中，但依赖天然植物提取花青素具有局限性。目前葡萄花色苷物质提取主要来源于葡萄酒行业的葡萄皮渣，但葡萄皮渣含糖量高、蛋白质高、杂质多，具有无毒化分离成本高，耗时久等缺点，且葡萄皮渣的来源受到市场、气候等条件限制，发展空间有限。随着食品行业的发展，以及人们对食品安全性的重视，在食品加工和保健品等行业对花色苷的需求日益增加，原有的来源途径不足以满足市场需求。因此，在“低碳经济”的条件下，通过刺葡萄细胞培养获取天然次生物质具有较大的可行性和规模化生产的潜力。目前，花色苷提取纯化主要的报道集中在葡萄皮渣等，尚未见到刺葡萄细胞花色苷提取、分离和纯化的报道，本专利技术通过刺葡萄愈伤组织细胞纯化花色苷的分离，获得食品级纯化花色苷，为通过刺葡萄细胞培养进行规模化、工厂化花色苷提取提供技术支撑，在食品、药品、化妆品等领域具有广泛的应用前景。

技术实现思路

[0003]本专利技术要解决的技术问题，在于提供一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，该方法对刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取效果好、纯度高、提取剂采用食品级乙醇与食品级柠檬酸作为混合提取溶剂，溶剂使用量小，无有毒物质残留，具备作为安全性食用花色苷生产的条件。
[0004]本专利技术是这样实现的：
[0005]一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，包含以下步骤：
[0006](1)刺葡萄愈伤组织细胞的获取：利用植物组织培养技术，将紫红色刺葡萄愈伤组织细胞培养在固体培养集中培养30～35d，即可获得充分成熟的、富含花色苷的刺葡萄愈伤组织细胞；
[0007](2)刺葡萄愈伤组织细胞的预处理：将步骤(1)获得的刺葡萄愈伤组织细胞从培养瓶中取出，去除培养基，收集刺葡萄愈伤组织细胞，用冷冻干燥法或低温真空干燥法进行干燥，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品；短时间保存可以置于4℃冰箱中冷藏，长期保存可置于
‑
40℃或
‑
80℃冰箱中冻存；
[0008](3)制备花色苷提取液：取步骤(2)获得的刺葡萄愈伤组织细胞干品，放入破壁匀浆机中，按提取液体体积与刺葡萄愈伤组织细胞干品重量的提取剂料比为18ml:1g的剂量，加入冷冻酸化70％～75％食品级乙醇，匀浆；匀浆后的提取混合液置于超声仪器中，于35℃～45℃、功率300W～400W、提取时间50min～60min，提取刺葡萄愈伤组织细胞中花色苷；超声结束后，于4℃、转速5000rpm～7000rpm，离心10min～15min，取上清；沉淀按上述操作再
次加入适当减量的提取剂提取花色苷，重复2次；最后合并上清液，即得刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液；
[0009](4)花色苷提取液过滤：将步骤(3)获得的刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液，通过0.22μm有机滤膜，进行真空抽滤，抽滤后，获得纯净的刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液；
[0010](5)花色苷提取液浓缩：将步骤(4)获得的纯净刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液转入旋转蒸发瓶中，于35℃～45℃水浴中，避光，进行真空蒸发浓缩，将乙醇与花色苷提取液分离，得到刺葡萄愈伤组织细胞花色苷浓缩液；
[0011](6)花色苷浓缩液检测：检测花色苷浓缩液的质量浓度；
[0012](7)花色苷纯化和洗脱：根据步骤(6)检测的花色苷浓缩液质量浓度，用酸化纯净水将花色苷浓缩液的浓度稀释至0.8～1.0mg/mL，将稀释后的花色苷稀释液通过预处理的弱极性或非极性高分子多孔微球的吸附与洗脱，获得纯化后的含有刺葡萄愈伤组织细胞花色苷的洗脱液；
[0013](8)纯化花色苷获取：将步骤(7)获得的纯化花色苷洗脱液，转入旋转蒸发瓶中，于35℃～45℃水浴中，避光，进行真空蒸发浓缩，至不能再蒸发出乙醇为止；获得的蒸发浓缩液预冷冻后，转入冷冻干燥机中，于
‑
45℃～50℃下，真空度15Pa～25Pa，冷冻干燥48～60h，获得纯化花色苷。
[0014]进一步地，所述固体培养基为添加了1.0mg/mL2,4
‑
D、30g/L糖、6g/L琼脂粉的MS固体培养基。
[0015]进一步地，所述步骤(2)中，所述刺葡萄愈伤组织细胞冷冻干燥具体步骤如下：将收集的刺葡萄愈伤组织细胞，用液氮迅速冷冻5～6min后，转入冷冻干燥机内，于
‑
45℃
‑
50℃、真空度15Pa～25Pa，冷冻干燥72～80h，取出后，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品。
[0016]进一步地，所述步骤(2)中，所述刺葡萄愈伤组织细胞低温真空干燥具体步骤如下：收集刺葡萄愈伤组织细胞，采用低温真空干燥机进行干燥，温度设置为35℃、真空度20～35Pa，将刺葡萄愈伤组织细胞干燥至恒重，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品。
[0017]进一步地，所述步骤(3)中，所述冷冻酸化70％～75％食品级乙醇的配制方法如下：首先按纯净水与食品级乙醇的体积比为2.5～3:7～7.5配制70％～75％食品级乙醇溶液；然后按质量体积分数比3～5:100(w/v)，配制含3％～5％柠檬酸的70％～75％食品级乙醇溶液，再将该溶液置于
‑
20℃冰箱中冷冻，即为冷冻酸化食品级乙醇。
[0018]进一步地，所述步骤(3)中，花色苷三次提取过程中，提取剂料比如下：首次提取时，提取剂体积与刺葡萄愈伤组织细胞质量的比为18mL:1g；离心后的沉淀进行第二次提取，提取剂体积与刺葡萄愈伤组织细胞质量的比为14mL:1g；再次离心后的沉淀进行第三次提取，提取剂体积与刺葡萄愈伤组织细胞质量的比为10mL:1g。
[0019]进一步地，所述步骤(6)所述花色苷浓度检测方法如下：精确称取矢车菊
‑3‑
葡萄糖苷标准品50mg，溶解于1mL定溶剂中，得50mg/mL标准液；
[0020]将标准液稀释为50μg/mL，再做2倍稀释，得50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.5625μg/mL6个浓度梯度。以定溶剂做空白调0，于酶标仪中测定波长530nm、620nm和650nm下的吸光值，用Greey公式OD
λ
＝(OD
530
‑
OD
620
)
‑
0.1(OD
650
‑
OD
620
)，准确计算出各浓度花色苷标准品的吸光值，绘制标准曲线；
[0021]将刺葡萄愈伤组织细胞花色苷浓缩液稀释至一定倍数，按照花色苷标曲建立的测定步骤测定花色苷提取液吸光值；通过矢车菊
‑3‑
葡萄糖苷标准曲线，计算出样品中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)刺葡萄愈伤组织细胞的获取：利用植物组织培养技术，将紫红色刺葡萄愈伤组织细胞培养在固体培养集中培养30～35d，即可获得充分成熟的、富含花色苷的刺葡萄愈伤组织细胞；(2)刺葡萄愈伤组织细胞的预处理：将步骤(1)获得的刺葡萄愈伤组织细胞从培养瓶中取出，去除培养基，收集刺葡萄愈伤组织细胞，用冷冻干燥法或低温真空干燥法进行干燥，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品；短时间保存可以置于4℃冰箱中冷藏，长期保存可置于
‑
40℃或
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80℃冰箱中冻存；(3)制备花色苷提取液：取步骤(2)获得的刺葡萄愈伤组织细胞干品，放入破壁匀浆机中，按提取液体体积与刺葡萄愈伤组织细胞干品重量的提取剂料比为18ml:1g的剂量，加入冷冻酸化70％～75％食品级乙醇，匀浆；匀浆后的提取混合液置于超声仪器中，于35℃～45℃、功率300W～400W、提取时间50min～60min，提取刺葡萄愈伤组织细胞中花色苷；超声结束后，于4℃、转速5000rpm～7000rpm，离心10min～15min，取上清；沉淀按上述操作再次加入适当减量的提取剂提取花色苷，重复2次；最后合并上清液，即得刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液；(4)花色苷提取液过滤：将步骤(3)获得的刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液，通过0.22μm有机滤膜，进行真空抽滤，抽滤后，获得纯净的刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液；(5)花色苷提取液浓缩：将步骤(4)获得的纯净刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取液转入旋转蒸发瓶中，于35℃～45℃水浴中，避光，进行真空蒸发浓缩，将乙醇与花色苷提取液分离，得到刺葡萄愈伤组织细胞花色苷浓缩液；(6)花色苷浓缩液检测：检测花色苷浓缩液的质量浓度；(7)花色苷纯化和洗脱：根据步骤(6)检测的花色苷浓缩液质量浓度，用酸化纯净水将花色苷浓缩液的浓度稀释至0.8～1.0mg/mL，将稀释后的花色苷稀释液通过预处理的弱极性或非极性高分子多孔微球的吸附与洗脱，获得纯化后的含有刺葡萄愈伤组织细胞花色苷的洗脱液；(8)纯化花色苷获取：将步骤(7)获得的纯化花色苷洗脱液，转入旋转蒸发瓶中，于35℃～45℃水浴中，避光，进行真空蒸发浓缩，至不能再蒸发出乙醇为止；获得的蒸发浓缩液预冷冻后，转入冷冻干燥机中，于
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45℃～50℃下，真空度15Pa～25Pa，冷冻干燥48～60h，获得纯化花色苷。2.根据权利要求1所述的一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，其特征在于：所述固体培养基为添加了1.0mg/mL2,4
‑
D、30g/L糖、6g/L琼脂粉的MS固体培养基。3.根据权利要求1所述的一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述刺葡萄愈伤组织细胞冷冻干燥具体步骤如下：将收集的刺葡萄愈伤组织细胞，用液氮迅速冷冻5～6min后，转入冷冻干燥机内，于
‑
45℃
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50℃、真空度15Pa～25Pa，冷冻干燥72～80h，取出后，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品。4.根据权利要求1所述的一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述刺葡萄愈伤组织细胞低温真空干燥具体步骤如下：收集刺
葡萄愈伤组织细胞，采用低温真空干燥机进行干燥，温度设置为35℃、真空度20～35Pa，将刺葡萄愈伤组织细胞干燥至恒重，获得刺葡萄愈伤组织细胞干品。5.根据权利要求1所述的一种可食用刺葡萄愈伤组织细胞花色苷提取纯化的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述冷冻酸化70％～75％...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖呈纯，张静，赖恭梯，潘红，黄贤贵，高慧颖，王琦，
申请(专利权)人：福建省农业科学院农业工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：