重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法技术

本发明专利技术提供了一种重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法,包括：利用大肠杆菌密码子的偏好性对重组人纤连蛋白进行密码子优化，构建重组表达载体。利用基因工程方法进行表达纯化，通过AKTA纯化仪使用PMB柱除细菌内毒素。经通过本发明专利技术的技术方案，重组人纤连蛋白纯化时间短，表达量高，纯度可达94%

【技术实现步骤摘要】
重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体而言，特别涉及一种重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法。

技术介绍

[0002]纤连蛋白（fibronectin，英文缩写FN）是一种在血液、间质外基质和细胞周基质中发现的关键黏附蛋白，是一种大分子糖蛋白，其分子量大约是440KD，由几乎两个相同的单体通过C末端二硫键相连。主要包括三种类型：I型、II型、III型。其中I型和II型含有链内二硫键，III型不含二硫键，使其在外力作用下可以部分展开。纤维连接蛋白（FN），其主要功能是增强细胞间粘连及细胞与基质的粘连，在调节细胞粘附、迁移、增殖等过程中发挥重要作用。
[0003]现有的FN大多数是动物的血液或组织中提取的天然的纤连蛋白，其产量有限、成本昂贵，限制了纤连蛋白的生产和在医疗、美容方面的应用。由于FN分子量太大（由2000多个氨基酸组成），难以被皮肤吸收。利用基因工程技术构建出与天然纤连蛋白在功能上相似的小分子重组纤连蛋白，有效解决了天然纤连蛋白分子过大难以生产的缺点，同时还保留了纤连蛋白活性，降低生产成本。

技术实现思路

[0004]为了弥补现有技术的不足，本专利技术提供了一种重组人纤连蛋白及其制备、活性测定和稳定性实验方法。
[0005]本专利技术是通过如下技术方案实现的：1.一种重组人纤连蛋白（rhFN），其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
[0006]一种重组人纤连蛋白的制备方法,其特征在于,所述制备方法具体包括以下步骤：S1:表达；将重组质粒rhFN
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pET28a(+)转入大肠杆菌BL21(DE3)，获得阳性基因工程菌BL21(DE3)/pET28a
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rhFN；经卡那霉素抗性LB平板筛选的阳性转化子，接种至10mL卡那霉素抗性LB培养基中过夜培养；S2：诱导；次日进行转接，培养至对数生长期加入诱导剂IPTG进行诱导发酵，20℃诱导16小时，离心收集菌体；S3:鉴定；S2的诱导过程中对未诱导菌液、诱导完成的菌液分别取样1.5mL，4℃、12000
×
g、5min离心收集菌体，1.5mLPBS复溶菌体，将菌体进行低温超声破碎，超声完成后，4℃、12000
×
g、5min离心分离上清及沉淀，用1.5mLPBS复溶沉淀；取未诱导菌液、诱导菌液、破碎离心上清、破碎离心沉淀样品各32μL，加入5
×
蛋白上样缓冲液，SDS
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PAGE鉴定蛋白的表达情况；S4：纯化；使用AKTA纯化仪，连接Ni
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NTA柱，采用分步洗脱的方法进行纯化，低温破碎菌体，离心收集上清，经亲和层析纯化得到重组人纤连蛋白；S5：去除毒素；使用AKTA纯化仪，连接PMB柱除细菌内毒素。
[0007]作为优选方案，步骤S2中的具体步骤如下：次日按照终OD为0.04转接到700mLLB/瓶培养基中培养至OD600达到0.6~0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导发酵，IPTG为诱导剂，20℃诱导16小时，4℃、大于等于3000
×
g、40min离心收集菌体，得到菌泥，菌泥获得量为3g/L。
[0008]作为优选方案，步骤S4中的具体步骤如下：S41：菌泥进行重悬，重悬后使用超声破碎仪或高压均质仪破碎菌悬液；S42：破碎后的悬液加入到离心管中，平衡重量后，4℃、大于等于25000
×
g、30min，离心收集上清；S43：离心后的菌液上清使用抽滤装置进行过滤，经过0.22μm滤膜过滤后作为蛋白原液进行后续试验；S44：连接好AKTA和Ni
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NTA柱，使用5
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10倍柱体积的超纯水冲洗柱子，流速为柱料能承受最大流速的50%
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80%；S45:待流穿液电导值接近0且紫外吸收值无明显变化后，使用5
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8倍柱体积的A液平衡柱子，直至流穿液电导值和紫外吸收值均达到稳定不变为止，流速为柱料能承受的最大流速的30%
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50%；S46:平衡好柱子后开始上样，流速为柱料能承受的最大流速的10%
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30%，若蛋白原液体积较小而浓度较高，应适当减少流速或增加重复上样次数，当流穿液的紫外吸收值开始变化时，收集上样流穿液并取样进行SDS
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PAGE电泳；S47：上样完毕后，继续使用A液进行平衡，直至流穿液电导值和紫外吸收值接近上样前数值且稳定后，停止平衡；平衡流速为柱料能承受最大流速的30%
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50%；S48：柱子达到平衡后，采用分步洗脱的方式进行洗脱；第一步使用2%B和98%A进行洗脱，目的是洗脱杂蛋白。洗脱时流速为柱料能承受最大流速的30%
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50%；在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS
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PAGE电泳；S49：当步骤S48中第一步洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用5%B和95%A进行第二步洗脱，目的是洗脱杂蛋白。洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的30%
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50%。在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS
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PAGE电泳。
[0009]S410：当步骤S49中第二步洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用30%B和70%A进行第三步洗脱，目的是洗脱目的蛋白。洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的30%
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50%。在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS
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PAGE电泳；如图4所示。
[0010]S411：当步骤S410中第三步洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用100%B进行柱冲洗，洗去仍未洗下的蛋白；洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的30%
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50%；S412：使用ClinXImageAnalysis对SDS
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PAGE电泳结果进行灰度分析，计算蛋白纯度；蛋白条带分析见图5，蛋白纯度分析见图6。
[0011]S413：纯化后蛋白使用紫外分光光度计进行浓度测定；S414：纯化后的蛋白使用PALL30KD超滤管进行浓缩换液。离心程序为4℃，3800
×
g，4min，更换缓冲液为PBS，pH7.4；浓缩后蛋白再次使用紫外分光光度计进行浓度测定；S415：浓缩后的蛋白取一部分进行稳定性试验，均分为两份，一份添加2%~5%终浓度的海藻糖和甘露醇，一份不添加任何保护剂，0.22μm滤器过滤除菌后放置于4℃冰箱过夜保存，第二天进行浓度测定。
[0012]作为优选方案，步骤S5中的具体步骤如下：S51：将PMB除细菌内毒素纯化柱连接至AKTA上，使用5倍柱体积的缓冲液C冲洗柱子，流速为柱料能承受最大流速的30%
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50%；S52：使用20倍柱体积的超纯水冲洗柱子，流速为柱料能承受最大流速的50%
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人纤连蛋白（rhFN），其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的一种重组人纤连蛋白的制备方法,其特征在于,所述制备方法具体包括以下步骤：S1:表达；将重组质粒rhFN
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pET28a(+)转入大肠杆菌BL21(DE3)，获得阳性基因工程菌BL21(DE3)/pET28a
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rhFN；经卡那霉素抗性LB平板筛选的阳性转化子，接种至10mL卡那霉素抗性LB培养基中过夜培养；S2：诱导；次日进行转接，培养至对数生长期加入诱导剂IPTG进行诱导发酵，20℃诱导16小时，离心收集菌体；S3:鉴定；S2的诱导过程中对未诱导菌液、诱导完成的菌液分别取样1.5mL，4℃、12000
×
g、5min离心收集菌体，1.5mLPBS复溶菌体，将菌体进行低温超声破碎，超声完成后，4℃、12000
×
g、5min离心分离上清及沉淀，用1.5mLPBS复溶沉淀；取未诱导菌液、诱导菌液、破碎离心上清、破碎离心沉淀样品各32μL，加入5
×
蛋白上样缓冲液，SDS
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PAGE鉴定蛋白的表达情况；S4：纯化；使用AKTA纯化仪，连接Ni
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NTA柱，采用分步洗脱的方法进行纯化，低温破碎菌体，离心收集上清，经亲和层析纯化得到重组人纤连蛋白；S5：去除毒素；使用AKTA纯化仪，连接PMB柱除细菌内毒素。3.根据权利要求2所述的一种重组人纤连蛋白的制备方法,其特征在于,所述步骤S2中的具体步骤如下：次日按照终OD为0.04转接到700mLLB/瓶培养基中培养至OD600达到0.6~0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导发酵，IPTG为诱导剂，20℃诱导16小时，4℃、大于等于3000
×
g、40min离心收集菌体，得到菌泥，菌泥获得量为3g/L。4.根据权利要求2所述的一种重组人纤连蛋白的制备方法,其特征在于,所述步骤S4中的具体步骤如下：S41：菌泥进行重悬，重悬后使用超声破碎仪或高压均质仪破碎菌悬液；S42：破碎后的悬液加入到离心管中，平衡重量后，4℃、大于等于25000
×
g、30min，离心收集上清；S43：离心后的菌液上清使用抽滤装置进行过滤，经过0.22μm滤膜过滤后作为蛋白原液进行后续试验；S44：连接好AKTA和Ni
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NTA柱，使用5
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10倍柱体积的超纯水冲洗柱子，流速为柱料能承受最大流速的50%
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80%；S45:待流穿液电导值接近0且紫外吸收值无明显变化后，使用5
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8倍柱体积的A液平衡柱子，直至流穿液电导值和紫外吸收值均达到稳定不变为止，流速为柱料能承受的最大流速的30%
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50%；S46:平衡好柱子后开始上样，流速为柱料能承受的最大流速的10%
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30%，若蛋白原液体积较小而浓度较高，应适当减少流速或增加重复上样次数，当流穿液的紫外吸收值开始变化时，收集上样流穿液并取样进行SDS
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PAGE电泳；S47：上样完毕后，继续使用A液进行平衡，直至流穿液电导值和紫外吸收值接近上样前数值且稳定后，停止平衡；平衡流速为柱料能承受最大流速的30%
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50%；S48：柱子达到平衡后，采用分步洗脱的方式进行洗脱；第一步使用2%B和98%A进行洗
脱，洗脱时流速为柱料能承受最大流速的30%
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50%；在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS
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PAGE电泳；S49：当步骤S48中第一步洗脱时的紫外吸收值不再变化时，使用5%B和95%A进行第二步洗脱，洗脱时的流速为柱料能承受最大流速的30%
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50%，在紫外吸收值开始出现变化时收集洗脱液，并取样进行SDS
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘传玉，王曼宇，李泽鹏，李晓晖，张俊梅，
申请(专利权)人：烟台科瑞斯生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：