一种利用乙酸生产柠檬酸或衣康酸的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法技术

一种利用乙酸生产柠檬酸或衣康酸的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法本研究属于基因工程领域。本研究公开了一种产柠檬酸或衣康酸的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是将柠檬酸合成酶基因CAS、乙酰辅酶A合成酶基因ACS、线粒体羧酸转运蛋白基因MTT以及顺乌头酸脱羧酶基因CADA导入亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母中，构建获得可以代谢乙酸的解脂耶氏酵母基因工程菌YLA01(含有基因CAS,ACS,MTT，)及YLA02(含有基因CAS,ACS,MTT,CADA)。本研究构建的解脂耶氏酵母基因工程菌能够利用乙酸作为碳源，高效的进行柠檬酸或衣康酸的生产，对发酵工业的废弃物乙酸提供了很好的解决办法。弃物乙酸提供了很好的解决办法。

【技术实现步骤摘要】
一种利用乙酸生产柠檬酸或衣康酸的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法


[0001]本研究属于基因工程领域，具体地涉及一种可以利用乙酸生产柠檬酸或衣康酸的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]柠檬酸，是各种柑橘类水果、菠萝、梨、桃和无花果的天然成分，是当今最重要的食品酸化剂，除了改善食物的风味，柠檬酸微也可以抑制微生物的生长，起到食品保鲜的作用，因此它在食品工业中的使用量一直是有机酸中最高的。此外，柠檬酸还可作为螯合剂和洗涤剂、动物饲料、润滑剂和增塑剂的首选添加剂。因此，柠檬酸市场需求巨大，并呈持续增长趋势。柠檬酸主要通过化学合成或者黑曲霉发酵的方式进行生产，黑曲霉一般都是利用葡糖糖、淀粉等粮食作物作为发酵底物，以乙酸或乙酸盐这类工艺废弃物作为碳源进行柠檬酸生产的例子很少。
[0003]衣康酸，其分子中含有一个碳碳双键以及两个化学活性比较强的羧基，因此，自身可以参与众多的化学反应，在聚合化学行业有着较为广泛的应用，被用于合成例如树脂、塑料、橡胶以及一些药物等方面。衣康酸的市场需求也十分巨大，土曲霉发酵一直是传统的衣康酸生产方式，但数十年过去，土曲霉生产衣康酸的产量得不到更高的提升，随着分子生物学技术的发展，利用代谢工程的手段，进行衣康酸的生产成为了当下的主流研究方向，同样的额，衣康酸的生产中，也很少涉及到以乙酸或乙酸盐作为底物的发酵生产工艺。
[0004]乙酸，也被称作醋酸，一般在生物合成中，乙酸常常以副产物的形式存在，并且通常是代谢废弃物，在工厂的废水中也含有大量的乙酸盐，因此，在对乙酸利用的探究中，既是为了开发新的碳源，也是遵循绿色化学的原则，对废弃物再利用的一个过程。此外，在乙酸转化为柠檬酸的过程中，乙酸可以比较容易的转化为乙酰辅酶A，再与草酰乙酸结合成为柠檬酸，从碳链的传递上比葡萄糖这类传统碳源要短很多，因此是一种比较有利的生产柠檬酸的碳源。
[0005]解脂耶氏酵母是一种油脂酵母菌，能将大部分碳原转化为脂肪酸。它已被公认为食品和保健品行业生产有机酸和天然产品的安全(GRAS)生物体，具有降解多种底物的能力，包括己糖/戊糖、甘油、碳氢化合物、挥发性脂肪酸(VFA)、农业废弃物和甚至尿素或尿液，并且可以产生包括柠檬酸、异柠檬酸、α
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酮戊二酸和丙酮酸在内的各种有机酸，是非常有利的有机酸生产菌株。
[0006]但是，目前还未见到以乙酸作为碳源利用解脂耶氏酵母进行柠檬酸生产的相关报道。

技术实现思路

[0007]本研究通过构建解脂耶氏酵母利用乙酸到柠檬酸或衣康酸的合成途径，所构建的基因工程菌株含有来源于Yarrowia lipolytic的柠檬酸合成酶基因CAS、乙酰辅酶A合成酶
基因ACS，还有来源于Aspergillus terreus线粒体羧酸转运蛋白基因MTT、顺乌头酸脱羧酶基因CADA，本研究构建解脂耶氏酵母的基因工程菌，可为进一步利用乙酸或乙酸盐合成柠檬酸或衣康酸打下基础。
[0008]因此，本研究的第一个目的是克服现有技术的不足，提供一种可以利用乙酸产柠檬酸或衣康酸的解脂耶氏酵母基因工程菌。
[0009]本研究的第二个目的是提供一种利用乙酸产柠檬酸或衣康酸的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法。
[0010]本研究的第三个目的是提供一种利用乙酸产柠檬酸或衣康酸的的解脂耶氏酵母基因工程菌的应用。
[0011]为了实现上述目的，本研究采用如下技术方案：
[0012]作为本研究的第一个方面，一种产柠檬酸或衣康酸的解脂耶氏酵母基因工程菌，将柠檬酸合成酶基因CAS、乙酰辅酶A合成酶基因ACS以及线粒体羧酸转运蛋白基因MTT导入亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母中，构建获得可以代谢乙酸的解脂耶氏酵母基因工程菌YLA01；将柠檬酸合成酶基因CAS、乙酰辅酶A合成酶基因ACS以及线粒体羧酸转运蛋白基因MTT、顺乌头酸脱羧酶基因CADA导入亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母中，构建获得可以代谢乙酸的解脂耶氏酵母基因工程菌YLA02,其中，
[0013]所述柠檬酸合成酶基因CAS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，乙酰辅酶A合成酶基因ACS的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述线粒体羧酸转运蛋白基因MTT的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述顺乌头酸脱羧酶基因CADA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0014]根据本研究，所述的亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母。
[0015]作为本研究的第二个方面，一种产柠檬酸及衣康酸的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
[0016]步骤一、利用同源重组以及T4连接的方式，依次将柠檬酸合成酶基因CAS、乙酰辅酶A合成酶基因ACS、线粒体羧酸转运蛋白基因MTT共三个基因连接至表达质粒PYLXP
’
上，得到重组质粒PYcam，利用同源重组以及T4连接的方式将柠檬酸合成酶基因CAS、乙酰辅酶A合成酶基因ACS、线粒体羧酸转运蛋白基因MTT、顺乌头酸脱羧酶基因CADA连接至表达质粒PYLXP
’
上，得到重组质粒PYcama。。
[0017]步骤二、将上述重组质粒，利用醋酸锂化转法，导入至解脂耶氏酵母内，构建菌株YLA01(PYcam)和YLA02(PYcama)。
[0018]醋酸锂化转法：
[0019]①
将新鲜的酵母POIG利用平板划线法接种于YPD平板，30℃培养24h，这一步的目的是为了活化菌体。
[0020]②
挑选单菌落，平板划线至另一个干净的YPD平板中，培养20
‑
22h。
[0021]③
将90μL的体积分数为50％的PEG4000、5μL鲑鱼精单链DNA以及5μL的醋酸锂(2mol/L)在超净台中加至一灭菌的离心管中，旋涡震荡混匀。
[0022]④
将步骤2培养好的酵母菌体刮至混匀体系中，菌体量不宜过多，要保证能震荡混匀。至此可以认为酵母感受态已经制备好。
[0023]⑤
向上述细胞中加入800
‑
1000ng重组质粒，取出混匀后30℃温水中放置40min，每600s取出漩涡震荡混匀。
[0024]⑥
将混好的转化体系转至39℃中放置600s。
[0025]⑦
到时后取出，加入100μL的无菌水，充分混合。
[0026]⑧
将混好的体系在亮氨酸缺陷培养基上涂板，30℃培养3天。
[0027]根据本研究，所述的重组质粒PYcam，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的重组质粒PYcama，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0028]作为本研究的第三个方面，一种如上所述的产柠檬酸或衣康酸的解脂耶氏酵母基因工程菌在生产柠檬酸和衣康酸中的应用，所述的解脂耶氏酵母基因工程菌能够利用乙酸或是乙酸盐直接作为碳源，产柠檬酸或衣康酸。
[0029]进一步的，培养上述产柠檬本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产柠檬酸的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，是将来源于解脂耶氏酵母内源的柠檬酸合成酶基因CAS、乙酰辅酶A合成酶基因ACS以及土曲霉源的线粒体羧酸转运蛋白基因MTT在解脂耶氏酵母体内表达，构建获得可以代谢生产柠檬酸的解脂耶氏酵母基因工程菌YLA01，其中，所述柠檬酸合成酶基因CAS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，乙酰辅酶A合成酶基因ACS的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所线粒体羧酸转运蛋白基因MTT的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.一种产衣康酸的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，是将来源于解脂耶氏酵母内源的柠檬酸合成酶基因CAS、乙酰辅酶A合成酶基因ACS以及土曲霉源的线粒体羧酸转运蛋白基因MTT、顺乌头酸脱羧酶基因CADA在解脂耶氏酵母体内表达，构建获得可以代谢生产柠檬酸的解脂耶氏酵母基因工程菌YLA02，其中，所述柠檬酸合成酶基因CAS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，乙酰辅酶A合成酶基因ACS的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述线粒体羧酸转运蛋白基因MTT的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述顺乌头酸脱羧酶基因CADA的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓利，萧琦，刘欢，刘军锋，王芳，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：