区分肝癌和正常人的末端唾液酸化异构糖肽标志物及其筛查方法技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体为一种区分肝癌和正常人的末端唾液酸化异构糖肽标志物及其筛查方法。本发明专利技术在特定色谱保留时间下，在质谱碰撞池中选择其母离子进行碎裂，随后全部碎片离子进入离子淌度池进行分离分析，最终进行质谱检测；通过末端唾液酸α2,6和α2,3异构体B

【技术实现步骤摘要】
区分肝癌和正常人的末端唾液酸化异构糖肽标志物及其筛查方法


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及区分肝癌和正常人的末端唾液酸化异构糖肽标志物及其筛查方法。

技术介绍

[0002]糖基化是生物体中广泛存在的一种复杂的翻译后修饰(PTM)，对蛋白质的化学和生物学特性有着重要的影响。在人类糖蛋白上，唾液酸是一种酸性9碳糖家族；在唾液酸转移酶作用下，唾液酸通过α2,3或α2,6键连接到半乳糖(Gal)残基上。血清蛋白的唾液酸化修饰在生物过程中具有重要的意义，包括免疫细胞追踪、微生物附着、凝血和炎症稳态，因此，唾液酸连接异构体的研究对于更好地理解糖基化的作用具有非常重要的意义。
[0003]肝细胞癌是我国高发恶性肿瘤之一，位居肿瘤死亡率的第二位。早诊断、早治疗是提高肝癌患者生存率的关键。目前临床上主要采用甲胎蛋白（Alpha fetoprotein, AFP）结合影像学及病理学检查进行肝癌的早期诊断，但其敏感性和特异性均不足。随着分子生物学研究的深入，新的肝癌标志物不断被发现，推动了肝癌的早期诊断，特别是一些糖蛋白及其特异修饰糖链结构等。
[0004]触珠蛋白(Hp)是一种高度唾液酸化的糖蛋白，据报道在各种类型的癌症中具有异常的N
‑
糖基化，如肝细胞癌(HCC)。在之前的研究中，我们发现肝病患者血清触珠蛋白β链上的总N
‑
聚糖和位点特异性唾液酸化N
‑
聚糖与健康人相比存在明显的差异，说明Hp的聚糖在肝癌的发生过程中有着一定的作用。但是，针对Hp的N
‑
糖肽末端唾液酸化连接异构没有被深入研究和探索。
[0005]因此，本领域技术人员针对现有技术不足，提供一类末端唾液酸化异构糖肽生物标志物，用于肝癌或者肝病人群的筛查，实现肝癌的早期干预治疗，降低肝癌病死率。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是针对肝癌早期诊断标志物敏感性和特异性的不足，提供一种区分肝癌和正常人的候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物及其筛查方法，以改变肝癌诊断的现状。
[0007]本专利技术提供的末端唾液酸化异构糖肽生物标志物，用于区分肝癌和正常人的候选末端唾液酸化异构糖肽;共有6个，分别为：MVSHH
184
N#LTTGATLINE
‑
H6N5S1；MVSHHN#LTTGATLINE
‑
H5N4F1S2；MVSHHN#LTTGATLINE
‑
H6N5S3；NLFL
207
N#HSE
‑
H5N4F1S2；NLFL
207
N#HSE
‑
H6N5S3；VVLHP
241
N#YSQVD
‑
H6N5F1S3 ；
（HexNAc : N; Hex : H; Fuc : F; NeuAc : S）。
[0008]各标志物可以单独区分，更可以组合区分。
[0009]本专利技术还提供肝癌和正常人候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物的筛查方法，具体步骤为：（1）采用上述糖肽生物标志物在特定色谱保留时间下，在质谱碰撞池中选择其母离子进行碎裂；（2）然后，全部碎片离子进入离子淌度池进行分离分析，最终进行质谱检测；（3）通过末端唾液酸α2,6和α2,3异构体B
3+
碎片（[NeuAcα2
‑
3/α2
‑
6Galβ1
‑
4GlcNAc]+
, m/z 657.24）淌度到达时间分布面积进行比较，对得到的α2,6和α2,3异构体B
3+
碎片相对比值进行分析，确定所述候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物。
[0010]本专利技术提供的肝癌和正常人候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物的筛查方法，具体操作流程为：（1）纯化血清触珠蛋白：血清样本在10000～15000*g离心10～15分钟，随后使用HiTrap柱子进行纯化。结合柱上的Hp用洗脱缓冲液(pH 3.0, 100 mM Glycine, 0.5 M NaCl)洗脱，后丙酮沉淀浓缩。
[0011]（2）Hp蛋白酶解：对于正常人和肝癌患者纯化的血清Hp，取一定体积浓度为1mg/mL的触珠蛋白，按1：20的体积比加入浓度为200～300mM二硫苏糖醇（DTT）溶液， 56～60 ℃下反应0.5～1h，进行蛋白质的变性和还原处理。随后按1：20的体积比加入400～600mM的碘乙酰胺溶液（IAA），室温下避光反应0.5～1h进行蛋白质的烷基化处理。最后按着蛋白与胰蛋白酶50：1加入一定质量的胰蛋白酶进行蛋白质的酶解，在37 ℃酶解过夜，加入一定量Glu
‑
C消化继续酶解12～16h（按着蛋白：Glu
‑
C= 50：1）。最终加入10～20μL甲酸溶液进行酶解反应的终止。
[0012]（3）HILIC富集N
‑
糖肽：首先用200～500μL平衡液（80～75% ACN/0.1% TFA）平衡HILIC柱3～4次；再溶于平衡液的触珠蛋白酶解肽段上样3～4次后，用平衡液洗涤富集糖肽的HILIC柱3～4次；最后，用300～500μL 0.1% TFA的洗脱液洗脱富集在HILIC上的N
‑
糖肽2～4次，合并洗脱液后真空离心干燥待用。
[0013]（4）LC
‑
MS/MS分析：在线 LC 采用 Waters 公司 M
‑
Class nano
‑
LC 系统：A 相为 0.1 % FA 水溶液；B 相为 0.1 % FA 的ACN 溶液。完整N
‑
糖肽采用 on
‑
column 上样，上样流速为 0.2～0.3 μL/min，上样 4～5 min；随后进入分析柱分离，色谱柱采用15～25 cm C18 柱 (nanoE MZ PST CSH130 C18 1.7μ 75 μm x 150 mm)：采用60～90分钟的梯度，从1～2%的B相开始，40～60分钟后从35～40%的B相开始，5～10分钟后增加到80～85%的B相，然后调整到1～2% B相。
[0014]（5）N
‑
糖肽数据检索：采用Byonic
TM
软件(version 2.16.11, Protein Metrics, San Carlos, CA)检索触珠蛋白序列(P00738)的原始数据文件，设定母离子和子离子的质量误差分别为10～20 ppm和0.03～0.05 Da。零缺失的切割位点被胰蛋白酶、V8蛋白酶消化。固定修饰为氨基甲酰化(C)，变量修饰为氧化(M)和去酰胺化(N)。结果在1～1.2% FDR下进行过滤，Byonic评分>150的置信阈值下进行手工验证。检索出的高可信N
‑
糖肽用于本专利技术中的末端唾液酸化异构糖肽生物标志物的筛查。
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种末端唾液酸化异构糖肽生物标志物，其特征在于，用于区分肝癌和正常人的候选末端唾液酸化异构糖肽；共有6个，分别为：MVSHH
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N#LTTGATLINE
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H6N5S1；MVSHHN#LTTGATLINE
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H5N4F1S2；MVSHHN#LTTGATLINE
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H6N5S3；NLFL
207
N#HSE
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H5N4F1S2；NLFL
207
N#HSE
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H6N5S3；VVLHP
241
N#YSQVD
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H6N5F1S3 ；各标志物单独用于区分，或组合用于区分。2.一种如权利要求1所述肝癌和正常人候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物的筛查方法，其特征在于，具体步骤为：（1）采用上述糖肽生物标志物在特定色谱保留时间下，在质谱碰撞池中选择其母离子进行碎裂；（2）然后，全部碎片离子进入离子淌度池进行分离分析，最终进行质谱检测；（3）通过末端唾液酸α2,6和α2,3异构体B
3+
碎片淌度到达时间分布面积进行比较，对得到的α2,6和α2,3异构体B
3+
碎片相对比值进行分析，确定所述候选末端唾液酸化异构糖肽生物标志物。3.根据权利要求2所述的筛查方法，其特征在于，具体操作流程为：（1）纯化血清触珠蛋白：血清样本在10000～15000*g离心10～15分钟，随后使用HiTrap柱子进行纯化；结合柱上的Hp用洗脱缓冲液洗脱，后丙酮沉淀浓缩；（2）Hp蛋白酶解：对于正常人和肝癌患者纯化的血清Hp，取一定体积浓度为1mg/mL的触珠蛋白，按1：20的体积比加入浓度为200～300mM二硫苏糖醇溶液，56～60 ℃下反应0.5～1h，进行蛋白质的变性和还原处理；随后按1：20的体积比加入400～600mM的碘乙酰胺溶液，室温下避光反应0.5～1h进行蛋白质的烷基化处理；最后按蛋白与胰蛋白酶50：1的体积比加入胰蛋白酶进行蛋白质的酶解，在37 ℃酶解过夜，加入Glu
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C消化继续酶解12～16h；最终加入10～20μL甲酸溶液进行酶解反应的终止；（3）HILIC富集N
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糖肽：首先用200～500μL平衡液平衡HILIC柱3～4次；再溶于平衡液的触珠蛋白酶解肽段上样3～4次后，用平衡液洗涤富集糖肽的HILIC柱3～4次；最后，用300～500μL 0.1% TFA的洗脱液洗脱富集在HILIC上的N
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糖肽2～4次，合并洗脱液后真空离心干燥待...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏黎明，封晓晓，陆豪杰，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：