一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白、基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白、基因及应用。本发明专利技术经筛选得到了一个新的LysR家族转录调控基因BysR的框内缺失突变株，该突变株表现出明显降低的抑制纹枯病菌的活性，且JP2

【技术实现步骤摘要】
一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白、基因及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白、基因及应用。

技术介绍

[0002]伯克霍尔德氏菌是属于β
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变形菌纲的革兰氏阴性细菌，被发现广泛存在于水、土壤、植物、动物和人等多种生态环境中。伯克霍尔德氏菌通常具有大而复杂的基因组，染色体拷贝一般为2
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5个，其基因组上具有大量的次生代谢物合成基因簇，能够分泌多种次级代谢产物。伯克霍尔德氏菌基因组中聚酮合酶途径和非核糖体多肽途径的总量只低于放线菌，目前成为继放线菌之后的天然产物来源的第二大类细菌。然而其中大部分生物合成基因簇为未开发或者沉默的，要对这些未知基因簇加以开发和利用，则必须建立一套方便快速的遗传操作体系对这些未知基因簇进行挖掘和利用。然而，不同的伯克霍尔德氏菌株经常需要不同的遗传操作方法。例如：泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)它常处于一种自然感受态的状态，引入外源质粒进行遗传操作的最有效方法是通过接合转移(Garcia EC：Burkholderia thailandensis：Genetic Manipulation.Current protocols in microbiology 2017，45：4C 2 1
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4C 2 15.)，而吡咯伯克霍尔德氏菌JK
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SH007则是采用改良的热激法实现高效的遗传转化。
[0003]申请人前期的专利申请，公开号为CN109234211A的专利技术申请公开了一株伯克霍尔德氏菌JP2
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270(CCTCC NO：M 2018703)，是一株分离自水稻根系的革兰氏阴性生防细菌，对水稻纹枯病具有一定的防治效果。JP2
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270属于洋葱伯克霍尔德氏菌群(Burkholderia cepacia Complex，Bcc)，该菌群是一组表型相近但基因型不同的复合物。伯克霍尔德氏菌通常都具有合成吡咯菌素(pyrrolnitrin)的能力，吡咯菌素表现出很好的抗真菌活性。本专利技术专利中的伯克霍尔德氏菌也能够产生吡咯菌素。而JP2
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270用类似于泰国伯克霍尔德氏菌的遗传操作方法是无法成功实现外源质粒的导入，用普通或者改良的热激法也无法实现高效的遗传转化。为了实现对该菌株基因的编辑，进一步阐明生防菌Burkholderia sp.JP2
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270抗真菌的分子机理，我们需要建立一种适合于伯克霍尔德氏菌JP2
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270的遗传转化体系。

技术实现思路

[0004]本申请提供了一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白、基因及应用，通过一种高效、快速实现伯克霍尔德氏菌JP2
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270遗传物质重组和基因编辑的操作方法，成功获得一个新的LysR家族转录调控基因BysR的框内缺失突变株，该突变株表现出明显降低的抑制纹枯病菌的活性，且JP2
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270发酵代谢物中吡咯菌素的合成也受到阻断。
[0005]一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白，所述LysR家族转录调控蛋白为BysR蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0006]本专利技术又提供了编码所述LysR家族转录调控蛋白的基因。优选的，所述基因命名为bysR基因，基因序列如SEQ ID No.1所示。
[0007]本专利技术又提供了所述的基因在调控吡咯菌素合成中的应用。过表达bysR基因后的伯克霍尔德氏菌抑制纹枯病菌活性明显高于野生型菌株。
[0008]优选的，所述的应用，筛选bysR基因高表达的伯克霍尔德氏菌来获得高产吡咯菌素的伯克霍尔德氏菌。
[0009]优选的，所述的应用，将bysR基因导入伯克霍尔德氏菌中进行过表达，从而获得高产吡咯菌素的重组伯克霍尔德氏菌。
[0010]优选的，所述的应用，将bysR基因序列克隆到表达载体中获得重组表达载体，再将重组表达载体通过电转化法导入伯克霍尔德氏菌感受态细胞中获得重组伯克霍尔德氏菌。
[0011]优选的，所述的应用，将重组表达载体通过电转化法导入伯克霍尔德氏菌感受态细胞中的步骤包括：
[0012](1)制备伯克霍尔德氏菌感受态细胞，制备时先将伯克霍尔德氏菌活化培养，然后将培养的伯克霍尔德氏菌使用体积浓度为10％的甘油水溶液洗涤，
[0013](2)将洗涤后的伯克霍尔德氏菌在体积浓度为10％的甘油水溶液保护下液氮冷冻30秒钟，制备得到伯克霍尔德氏菌感受态细胞，
[0014](3)将重组表达载体加入伯克霍尔德氏菌感受态细胞中，然后进行电转化，电转化后进行抗性筛选，获得转入有重组表达载体的伯克霍尔德氏菌。
[0015]本专利技术经筛选得到了一个新的LysR家族转录调控基因BysR的框内缺失突变株，该突变株表现出明显降低的抑制纹枯病菌的活性，且JP2
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270发酵代谢物中吡咯菌素的合成也受到阻断，经进一步研究发现了一种调控吡咯菌素合成的LysR家族转录调控基因，所述LysR家族转录调控蛋白为BysR蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，对应基因命名为bysR基因，基因序列如SEQ ID No.1所示。本申请为进一步提高吡咯菌素的生物合成量提供遗传基础。
附图说明
[0016]图1为PCR验证bysR成功缺失的突变株检测结果图，其中，M：marker；+：阳性对照，质粒pK18
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bysR；
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：阴性对照，M 2018703基因组DNA；7
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12：随机挑选的6株待检测双交换突变株基因组DNA。其中，泳道11与重组质粒pK18
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bysR对照一致，为正确双交换突变株。
[0017]图2为化学转化法和改良电转化法克隆效率比较结果图，其中，A：化学转化法；B：改良电转化法。
[0018]图3为JP2
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270各个衍生菌株抑制纹枯病菌活性检测结果图，其中，WT：JP2
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270；ΔbysR：JP2
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270ΔbysR；ΔbysR+pBBR2
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bysR：JP2
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270ΔbysR回补菌株；ΔbysR+pBBR2：JP2
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270ΔbysR含空载体对照菌株。
[0019]图4为JP2
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270及JP2
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270ΔbysR发酵产物HPLC分析结果图，其中，WT：JP2
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270；ΔbysR：JP2
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270ΔbysR；Prn标样：pyrrolnitrin标准品。
[0020]图5为JP2
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270及ΔbysR中回补bysR基因菌株发酵产物HPLC分析结果图，其中，WT：JP2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白，其特征在于，所述LysR家族转录调控蛋白为BysR蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。2.编码如权利要求1所述LysR家族转录调控蛋白的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因为bysR基因，基因序列如SEQ ID No.1所示。4.如权利要求3所述的基因在调控吡咯菌素合成中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，筛选bysR基因高表达的伯克霍尔德氏菌来获得高产吡咯菌素的伯克霍尔德氏菌。6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，将bysR基因导入伯克霍尔德氏菌中进行过表达，从而获得高产吡咯菌素的重组伯克霍尔德氏菌。7.如权利要求6所述的应用，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：鄂志国，吴丽娟，王磊，王惠梅，
申请(专利权)人：中国水稻研究所，
类型：发明
国别省市：