本发明专利技术涉及疫苗制备，具体涉及一种双链RNA复合物AUK及其在疫苗制备中的应用。本发明专利技术提供的双链RNA复合物，包含0.5-20mg/ml Poly A、0.5-20mg/ml Poly U和0.2-80mg/ml卡那霉素。该复合物能够有效激活鸡的免疫系统，增强抗原的免疫效力，有望作为禽类特异性TLR3激动剂用于制备疫苗佐剂。剂用于制备疫苗佐剂。
【技术实现步骤摘要】
一种双链RNA复合物AUK及其在疫苗制备中的应用
[0001]本专利技术涉及疫苗制备，具体涉及一种双链RNA复合物AUK及其在疫苗制备中的应用。
技术介绍
[0002]1925年法国免疫学家Gaston Ramon发现，在疫苗中加入某些与疫苗有效成分无关的物质能够特异性的增强机体对相应病原的免疫应答反应。先于抗原或与抗原混合同时免疫动物，能增强机体对该抗原的特异型免疫应答的物质被称为佐剂或免疫增强剂。性能优良的佐剂和免疫增强剂能够显著提高传统疫苗和基因工程疫苗的免疫活性、降低接种成本、改善疫苗应答水平。佐剂可以通过激活先天免疫应答，增加抗原提呈效率，因此使用佐剂提高疫苗效力是一种经济可靠的方法，对疫苗的生产研究具有重大的社会效益。在畜牧业的发展中，各种动物传染病的流行给畜牧业带来严重的经济损失，兽用疫苗的使用，有效防止了畜禽传染病对养殖业造成的损失，而免疫佐剂也广泛应用于兽用疫苗中，例如目前严重危害家禽养殖业的禽流感，在研制的灭活疫苗中均使用免疫佐剂。
[0003]我国自主研发的商品化佐剂较少，很多动物疫苗研发和生产一部分依赖进口佐剂；另一部分使用传统的白油佐剂。白油佐剂的免疫增强功能较好但是毒性强，易破坏动物的肉质；传统的白油乳化法工艺繁琐，设备要求高，增加了企业能耗，延长了疫苗的生产周期和增加了成分。一部分效果较好的新型疫苗佐剂如CpG佐剂、微囊化ISCOM和脂质体等佐剂对设备及工艺要求较高。因此，需要开发一种安全性高、免疫性强、低成本、环保性好的新型动物疫苗佐剂。
[0004]在病原体感染早期，先天免疫首先被激活，由模式识别受体(Pattern-recognition receptors,PRR)识别病原体相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMP)，激活树突状细胞分泌大量I型干扰素(IFNα/β)；激活专职性抗原提呈细胞(如树突状细胞DC、单核/巨噬细胞、B细胞等)呈递抗原给T细胞激活适应性免疫应答等。胞质区PRR Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是脊椎动物中一个保守的PRR家族，可以识别病原，在启动先天免疫反应中起着至关重要的作用。由TLRs介导的PAMP识别可诱导快速炎症反应。TLR3是细胞内受体，又被称之为抗病毒TLRs，识别细胞内外源双链RNA。TLR3表达于多种细胞类型，如髓样树突状细胞(DC)、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、神经细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肥大细胞和上皮细胞。TLR3激动剂主要是双链RNA(dsRNA)，已经被证明能有效增强DC介导的免疫反应。
[0005]Poly I:C作为病毒dsRNA的类似物，具有强大的抗病毒和抗癌潜力。Poly I:C是多种识别受体(PRR)的配体，其中包括蛋白激酶R、视黄酸诱导基因-I(RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)和Toll样受体(TLR3)。然而，Poly I:C诱导的细胞因子风暴在一些肿瘤治疗患者中引起了严重的毒性副作用，包括休克、肾功能衰竭、凝血疾病和超敏反应，因而限制了Poly I:C在临床的应用。Poly I:C的化学结构并不稳定，容易被含有RNase酶的体液降解，其半衰期仅为几分钟，低剂量使用时无法有效激活免疫系统，这进一步限制了其在疫苗
佐剂中的应用。
技术实现思路
[0006]为弥补上述领域存在的不足，本专利技术提供一种双链RNA复合物，该复合物能够有效激活实验鸡的免疫系统，增强抗原的免疫效力。
[0007]本专利技术提供的双链RNA复合物，其特征在于，包含0.5-20mg/ml Poly A、0.5-20mg/ml Poly U和0.2-80mg/ml卡那霉素。
[0008]在本专利技术的优选实施例中，所述双链RNA复合物由1.02mg/ml Poly A、0.98mg/ml Poly U和1.6mg/ml硫酸卡那霉素组成。
[0009]本专利技术还提供所述双链RNA复合物的制备方法，其特征在于，步骤如下：
[0010](1)使用磷酸盐缓冲液分别配制Poly A溶液、Poly U溶液和卡那霉素溶液，并水浴加热至40-60℃；
[0011](2)然后混合Poly A溶液、Poly U溶液和卡那霉素溶液，并将混合物置于40-60℃水浴中孵育30min；
[0012](3)取出混合物并置于0℃孵育1小时，过滤除菌，即得。
[0013]在本专利技术的优选实施例中，所述步骤(1)中，称取Poly A 0.1132g，加入49ml pH7.2 10mM PBS中，溶解后得Poly A溶液；称取Poly U 0.1152g，加入49ml pH7.2 10mM PBS中，溶解后得Poly U溶液；用pH7.2 10mM PBS配制80mg/ml硫酸卡那霉素溶液；所述步骤(2)中，将Poly A溶液、Poly U溶液和硫酸卡那霉素溶液按照0.49：0.49：0.02的体积比混合。
[0014]本专利技术还提供一种免疫佐剂，其特征在于，包含本专利技术所述的双链RNA复合物。
[0015]在本专利技术的优选实施例中，所述免疫佐剂含有1mg/ml本专利技术所述的双链RNA复合物、2.25mg/mlα-生育酚、10mg/ml吐温80和10mg/ml司盘80。
[0016]所述双链RNA复合物或所述免疫佐剂在疫苗制备中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0017]本专利技术还提供一种疫苗，其特征在于，包含抗原以及所述免疫佐剂。
[0018]在本专利技术的一些实施例中，所述抗原为灭活病毒。
[0019]在本专利技术的优选实施例中，每300μl疫苗中含有100μl所述双链RNA复合物，100μl毒价为10
7.5
EID50/0.1ml的灭活病毒，0.45mgα-生育酚，2mg吐温80和2mg司盘80，体积不足部分使用无菌的磷酸盐缓冲液补齐。
[0020]本专利技术还提供所述疫苗的制备方法，其特征在于，将抗原与所述免疫佐剂按照1:2的体积比混合后，强力搅拌均匀即可。
[0021]本专利技术根据TLR3激动剂的结构特点，在Poly A和Poly U退火合成过程中加入卡那霉素，混合后在40-60℃水浴中孵育30分钟，促使三种化合物形成了一种结构稳定的复合物，命名为AUK。
[0022]血清稳定性实验结果表明，在鸡血清中，AUK可稳定存在4天，Poly A:U和Poly I:C只能稳定存在1天。血清中含有RNase，能够降解dsRNA。不同物种血清中的RNase活性不同，在已知常见畜牧动物中鸡血清中的RNase的活性最强。AUK同Poly A:U和Poly I:C相比，在鸡血清中的稳定性大幅增强。这表明卡那霉素能有效地增加Poly A:U的稳定性，两者的复
合物AUK适用于禽类疫苗佐剂的开发。
[0023]CCK-8细胞毒性试验结果显示，使用20μg/ml AUK对CEF细胞进行不同时间的处理后，各处理时间的细胞活力同PBS对照组相比均无明显差异。这本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种双链RNA复合物，其特征在于，包含0.5-20mg/ml Poly A、0.5-20mg/ml Poly U和0.2-80mg/ml卡那霉素。2.根据权利要求1所述的双链RNA复合物，其特征在于，由1.02mg/ml Poly A、0.98mg/ml Poly U和1.6mg/ml硫酸卡那霉素组成。3.权利要求1或2所述的双链RNA复合物的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)使用磷酸盐缓冲液分别配制Poly A溶液、Poly U溶液和卡那霉素溶液，并水浴加热至40-60℃；(2)然后混合Poly A溶液、Poly U溶液和卡那霉素溶液，并将混合物置于40-60℃水浴中孵育30min；(3)取出混合物并置于0℃孵育1小时，过滤除菌，即得。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，称取Poly A 0.1132g，加入49ml pH7.2 10mM PBS中，溶解后得Poly A溶液；称取Poly U 0.1152g，加入49ml pH7.2 10mM PBS中，溶解后得Poly U溶液；用pH7.210mM PBS配制80mg/ml硫酸卡那...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭芳芳，徐福洲，曹晓亚，章振华，史爱华，崔一芳，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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