肝特异性调节性核酸序列制造技术

本发明专利技术涉及调节性核酸序列，特别是肝特异性顺式调节元件、顺式调节模块、启动子和其他这样的核酸序列，其能够增强基因的肝特异性表达。本发明专利技术还涉及包含这样的肝特异性调节性核酸序列的表达构建体、载体和细胞，以及涉及它们的使用方法。肝特异性调节性核酸序列特别地可用于基因治疗应用，但也可用于另一些领域，例如生物加工和生物技术。例如生物加工和生物技术。例如生物加工和生物技术。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肝特异性调节性核酸序列


[0001]本专利技术涉及调节性核酸序列，特别是肝特异性顺式调节元件、顺式调节模块、启动子和其他这样的核酸序列，其能够增强基因的肝特异性表达。本专利技术还涉及包含这样的肝特异性调节性核酸序列的表达构建体、载体和细胞，以及涉及它们的使用方法。肝特异性调节性核酸序列特别地可用于基因治疗应用，但也可用于另一些领域，例如生物加工和生物技术。

技术介绍

[0002]提供以下讨论以帮助读者理解本公开内容，并且以下讨论不构成对现有技术的内容或相关性的任何承认。
[0003]在许多领域(包括基因治疗)中，期望提供能够驱动基因表达的调节性核酸序列以在所期望的细胞、组织或器官内产生蛋白质或核酸表达产物。
[0004]在肝中的表达是特别令人感兴趣的，因为其涉及身体中的广泛范围的基本功能，包括参与代谢、止血和保护免受感染的许多蛋白质的合成。鉴于许多疾病与肝中基因表达的破坏有关，开发允许转基因在肝中表达以产生治疗性表达产物的基因治疗策略具有重要意义。与基因异常表达相关的肝疾病的一些实例包括血友病(包括血友病A或B)、家族性高胆固醇血症、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症、α
‑
抗胰蛋白酶缺乏症、肝炎病毒感染、非病毒性肝炎、肝癌和多种另一些肝病(例如非酒精性脂肪性肝病(non
‑
alcoholic fatty liver disease，NAFLD)和酒精相关性肝病(alcohol
‑
related liver disease，ARLD))。
[0005]使用基因治疗治疗肝病的重大挑战是提供肝特异性(liver
‑
specific)(也称为肝特异性(hepato
‑
specific))治疗性基因表达的能力。已知通过将DNA或病毒载体注射到肝实质、肝动脉或门静脉中来靶向哺乳动物肝细胞。据报道，腺病毒载体在小鼠中主要靶向肝。然而，它们也会感染其他组织，特别是肺和骨骼肌，导致“脱靶(off
‑
target)”效应。一些形式的腺相关病毒载体(adeno
‑
associated viral vector，AAV)或慢病毒载体优先转导肝细胞，但脱靶效应的确再次出现。
[0006]因此期望提供以肝特异性方式调节基因表达的系统。理想地，这样的系统对肝具有高度特异性(从而避免在非靶标组织中的脱靶表达或使其最小化)并且还是强有力的，即它们驱动肝中的高表达水平。已提议使用顺式作用调节元件来提供特异性和活性二者。通常来说，这涉及顺式调节增强子序列，即顺式作用以提高启动子活性的核酸序列。无论增强子的方向如何，其通常都是具有活性的，并且在一些情况下，它们可以在距启动子高至数千碱基的距离内发挥作用，尽管它们通常也在更接近启动子时发挥作用。
[0007]用于基因的肝特异性表达的多种增强子序列已经描述于文献中。WO95/011308和WO01/098482描述了包含与启动子和转基因连接的肝细胞特异性载脂蛋白E
‑
肝细胞控制区增强子的基因治疗载体。另一些肝特异性构建体也已在文献中提出，例如AAT启动子和白蛋白或乙型肝炎增强子，或醇脱氢酶6(alcohol dehydrogenase 6，ADH6)基础启动子，其与载脂蛋白E增强子元件的两个串联拷贝连接。WO2009/130208描述了多种肝特异性调节元件，
所述元件因为其相当短的长度而被描述为有利的。期望短长度的调节序列以使调节序列占据的基因治疗载体的比例最小化；这对于容量(有效载荷)有限的基因治疗载体(例如AAV载体)是特别重要的。
[0008]本领域仍然需要能够驱动肝特异性基因表达的调节性核酸。特别地，需要肝特异性调节序列(例如顺式调节元件和最小或近端启动子元件)，以及包含这样的元件的肝特异性顺式调节模块和启动子，其可并入表达构建体和载体中用于期望基因(例如基因治疗背景下的治疗性转基因)的肝特异性表达。
[0009]专利技术概述
[0010]在本专利技术的第一方面中，提供了包含选自以下的两种或更多种可操作连接的顺式调节元件(cis
‑
regulatory element，CRE)的合成肝特异性顺式调节模块(cis
‑
regulatory module，CRM)：
[0011]‑
CRE0018(SEQ ID NO：1)或其功能变体；
[0012]‑
CRE0042(SEQ ID NO：2)或其功能变体；
[0013]‑
CRE0051(SEQ ID NO：3)或其功能变体；
[0014]‑
CRE0058(SEQ ID NO：4)或其功能变体；
[0015]‑
CRE0065(SEQ ID NO：5)或其功能变体；
[0016]‑
CRE0066(SEQ ID NO：7)或其功能变体；
[0017]‑
CRE0068(SEQ ID NO：10)或其功能变体；和
[0018]‑
CRE0074(SEQ ID NO：11)或其功能变体。
[0019]在一些实施方案中，合成肝特异性CRM包含三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或者六种或更多种所述CRE。如下文更详细讨论的，已发现这些CRE有助于合成肝特异性启动子中存在的CRM的活性。
[0020]在一些实施方案中，本专利技术的合成肝特异性CRM包含选自以下的CRE或其功能变体的组合：
[0021]‑
CRE0051和CRE0058；
[0022]‑
CRE0051和CRE0042；
[0023]‑
CRE0051、CRE0058和CRE0065；
[0024]‑
CRE0051、CRE0058和CRE0066；
[0025]‑
CRE0051、CRE0058、CRE0065和CRE0066；
[0026]‑
CRE0018、CRE0051、CRE0058、CRE0065和CRE0066
[0027]‑
CRE0051、CRE0065和CRE0066；
[0028]‑
CRE0051、CRE0074和CRE0058；
[0029]‑
CRE0051、CRE0074、CRE0058和CRE0065；
[0030]‑
CRE0058和CRE0065；
[0031]‑
CRE0068和CRE0042；
[0032]‑
CRE0058、CRE0065和CRE0066；
[0033]‑
CRE0074、CRE0058和CRE0065；
[0034]‑
CRE0051、CRE0074、CRE0058、CRE0065和CRE0066；以及
[0035]‑
CRE0074、CRE0058、CRE006本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.合成肝特异性顺式调节模块(CRM)，其包含选自以下的两种或更多种可操作连接的顺式调节元件(CRE)：
‑
CRE0018(SEQ ID NO：1)或其功能变体；
‑
CRE0042(SEQ ID NO：2)或其功能变体；
‑
CRE0051(SEQ ID NO：3)或其功能变体；
‑
CRE0058(SEQ ID NO：4)或其功能变体；
‑
CRE0065(SEQ ID NO：5)或其功能变体；
‑
CRE0066(SEQ ID NO：7)或其功能变体；
‑
CRE0068(SEQ ID NO：10)或其功能变体；和
‑
CRE0074(SEQ ID NO：11)或其功能变体。2.权利要求1所述的合成肝特异性CRM，其包含三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或者六种或更多种所述CRE。3.权利要求1或2所述的合成肝特异性CRM，其包含选自以下的CRE或其功能变体的组合：
‑
CRE0051和CRE0058；
‑
CRE0051和CRE0042；
‑
CRE0051、CRE0058和CRE0065；
‑
CRE0051、CRE0058和CRE0066；
‑
CRE0051、CRE0058、CRE0065和CRE0066；
‑
CRE0018、CRE0051、CRE0058、CRE0065和CRE0066
‑
CRE0051、CRE0065和CRE0066；
‑
CRE0051、CRE0074和CRE0058；
‑
CRE0051、CRE0074、CRE0058和CRE0065；
‑
CRE0051、CRE0074、CRE0058、CRE0065和CRE0066；
‑
CRE0058和CRE0065；
‑
CRE0068和CRE0042；
‑
CRE0058、CRE0065和CRE0066；
‑
CRE0074、CRE0058和CRE0065；以及
‑
CRE0074、CRE0058、CRE0065和CRE0066。4.权利要求3所述的合成肝特异性CRM，其中所述CRE或其功能变体以所记载顺序存在于所述CRM中，并且优选地其中它们彼此相邻。5.任一前述权利要求中所述的合成肝特异性CRM，其包含选自以下的两种、三种、四种或更多种CRE：
‑
CRE0051或其功能变体；
‑
CRE0058或其功能变体；
‑
CRE0065或其功能变体；
‑
CRE0066或其功能变体；和
‑
CRE0074或其功能变体。6.任一前述权利要求中所述的合成肝特异性CRM，其还包含选自以下的一种或更多种
CRE：
‑
CRE0001(SEQ ID NO：12)或其功能变体；
‑
CRE0005(SEQ ID NO：13)或其功能变体；
‑
CRE0012(SEQ ID NO：14)或其功能变体；
‑
CRE0047(SEQ ID NO：15)或其功能变体；
‑
CRE0048(SEQ ID NO：16)或其功能变体；
‑
CRE0056(SEQ ID NO：17)或其功能变体；
‑
CRE0062(SEQ ID NO：18)或其功能变体；
‑
CRE0077(SEQ ID NO：19)或其功能变体；
‑
CRE0078(SEQ ID NO：20)或其功能变体；
‑
CRE0083.1(SEQ ID NO：21)或其功能变体；和
‑
CRE0089(SEQ ID NO：22)或其功能变体。7.任一前述权利要求中所述的合成肝特异性CRM，其包含选自以下的CRE或其功能变体的组合：
‑
CRE0018、CRE0077、CRE0074、CRE0058、CRE0065；
‑
CRE0068、CRE0042；
‑
CRE0051、CRE0058；
‑
CRE0051、CRE0042；
‑
CRE0065、CRE0051、CRE0083.1；
‑
CRE0018、CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0066；
‑
CRE0012、CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0066；
‑
CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0066；
‑
CRE0051、CRE0058、CRE0018；
‑
CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0018；
‑
CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0012；
‑
CRE0047、CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0066；
‑
CRE0051、CRE0074、CRE0058、CRE0065、CRE0066；
‑
CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0001；
‑
CRE0051、CRE0058、CRE0065；和
‑
CRE0051、CRE0066.2。8.权利要求7所述的合成肝特异性CRM，其中所述CRE或其功能变体以所记载顺序存在于所述CRM中，并且优选地其中它们彼此相邻。9.任一前述权利要求中所述的合成肝特异性CRM，其包含选自以下的CRE或其功能变体的组合：CRE0051、CRE0066.2；CRE0065、CRE0051、CRE0083.1；CRE0065、CRE0066.2；CRE0066、CRE0066；CRE0065、CRE0066；CRE0074、CRE0058、CRE0065.1；CRE0051、CRE0074、CRE0058、CRE0065.1；CRE0077、CRE0074、CRE0058、CRE0065.1；CRE0078、CRE0074、CRE0058、CRE0065.1；CRE0074、CRE0074、CRE0065；CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0074、CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0074、CRE0058；CRE0018、CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0051、CRE0058、CRE0065；CRE0012、CRE0051、
CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0012；CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0018；CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0001；CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0077；CRE0051、CRE0058、CRE0018；CRE0047、CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0077、CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0078、CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0051、CRE0074、CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0077、CRE0074、CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0078、CRE0074、CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0051、CRE0074、CRE0058；CRE0077、CRE0074、CRE0058；CRE0078、CRE0074、CRE0058；CRE0051、CRE0058；CRE0068、CRE0042；CRE0051、CRE0058、CRE0066；CRE0051、CRE0065、CRE0066；CRE0018、CRE0051、CRE0074、CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0018、CRE0077、CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0018、CRE0077、CRE0074、CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0018、CRE0077、CRE0074、CRE0058、CRE0065；和CRE0051、CRE0042。10.权利要求9所述的合成肝特异性CRM，其中所述CRE或其功能变体以所记载顺序存在于所述CRM中，并且优选地其中它们彼此相邻。11.任一前述权利要求中所述的合成肝特异性CRM，其包含选自以下的CRE或其功能变体的组合：
‑
CRE0018、CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0066；
‑
CRE0051CRE0058、CRE0065、CRE0012；
‑
CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0066；和
‑
CRE0051、CRE0042。12.权利要求11所述的合成肝特异性CRM，其中所述CRE或其功能变体以所记载顺序存在于所述CRM中，并且优选地其中它们彼此相邻。13.任一前述权利要求中所述的合成肝特异性CRM，其包含选自以下的CRM：CRM_SP0109、CRM_SP0112、CRM_SP0113、CRM_SP0121、CRM_SP0124、CRM_SP0127、CRM_SP0127A1、CRM_SP0127V1、CRM_SP0127V2、CRM_SP0128、CRM_SP0131、CRM_SP0132、CRM_SP0133、CRM_SP0239、CRM_SP0240、CRM_SP0241、CRM_SP0242、CRM_SP0243、CRM_SP0244、CRM_SP0246、CRM_SP0247、CRM_SP0248、CRM_SP0249、CRM_SP0250、CRM_SP0251、CRM_SP0253、CRM_SP0254、CRM_SP0255、CRM_SP0256、CRM_SP0257、CRM_SP0258、CRM_SP0265、CRM_SP0266、CRM_SP0267、CRM_SP0268、CRM_SP0269、CRM_SP0270、CRM_SP0271、CRM_SP0272、CRM_SP0273、CRM_SP0368、CRM_SP0373、CRM_SP0378、CRM_SP0379、CRM_SP0380、CRM_SP0381、CRM_SP0384、CRM_SP0396、CRM_SP0397、CRM_SP0398、CRM_SP0403、CRM_SP0404、CRM_SP0405、CRM_SP0406、CRM_SP0407、CRM_SP0409、CRM_SP0411、CRM_SP0412、CRM_SP0413，或其中任意的功能变体。14.任一前述权利要求中所述的合成肝特异性CRM，其包含CRM_SP0239、CRM_SP0244、CRM_SP0265或CRM_SP0412。15.任一前述权利要求中所述的合成肝特异性CRM，其长度为500个或更少的核苷酸，任选地为450、400、350、300、250、200、150、100、75、60、50个或更少的核苷酸。16.合成肝特异性启动子，其包含：a)与启动子元件可操作连接的根据权利要求1至15中任一项所述的CRM；或者b)至少一种以下CRE或其功能变体，其与选自CRE0059或其功能变体或者CRE0006或其功能变体的启动子元件可操作地连接；
‑
CRE0018或其功能变体；
‑
CRE0042或其功能变体；
‑
CRE0051或其功能变体；
‑
CRE0058或其功能变体；
‑
CRE0065或其功能变体；
‑
CRE0066或其功能变体；
‑
CRE0068或其功能变体；和
‑
CRE0074或其功能变体。17.权利要求16a)所述的合成肝特异性启动子，其包含选自以下的CRE或其功能变体的组合：CRE0051、CRE0066.2；CRE0065、CRE0051、CRE0083.1；CRE0065、CRE0066.2；CRE0066、CRE0066；CRE0065、CRE0066；CRE0074、CRE0058、CRE0065.1；CRE0051、CRE0074、CRE0058、CRE0065.1；CRE0077、CRE0074、CRE0058、CRE0065.1；CRE0078、CRE0074、CRE0058、CRE0065.1；CRE0074、CRE0074、CRE0065；CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0074、CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0074、CRE0058；CRE0018、CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0066；CRE0051、CRE0058、CRE0065、CRE0066；...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔，
申请(专利权)人：塞普洛麦克斯有限公司，
类型：发明
国别省市：