血红蛋白基因的编辑制造技术

本发明专利技术涉及一种制备修饰核酸的方法，其中所述核酸包含编码突变型Hb

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】血红蛋白基因的编辑
[0001]本专利技术涉及一种制备修饰核酸的方法，其中所述核酸包含编码突变型Hb
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β多肽的突变型血红蛋白B(HBB)基因。方法包括使用碱基编辑器(优选与gRNA一起)编辑突变型HBB基因以将该基因中的第一(突变型)密码子改变成第二非野生型密码子，其中由该编辑的HBB基因编码的Hb
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β多肽具有非野生型但表型上可行的氨基酸序列。本专利技术还提供一种分离的造血干细胞群，所述干细胞包含编辑的HBB基因。
[0002]血红蛋白(haemoglobin或hemoglobin)(Hb)是在除鳄冰鱼科(Channichthyidae)以外的所有脊椎动物的红细胞中发现的蛋白质，并且在一些无脊椎动物中也有。血红蛋白在血液中将氧气从肺或鳃携带到身体组织，以允许进行有氧呼吸。血红蛋白还携带其他气体诸如二氧化碳。
[0003]血红蛋白由与非蛋白血红素辅基相关的多个球蛋白链亚基组成。血红素基团由卟啉杂环中的铁离子组成。铁离子与氧结合。成年人中大多数血红蛋白蛋白呈血红蛋白A(HbA)的形式。此四聚体由两个α(Hb
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α1和Hb
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α2)和两个β(Hb
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β)亚基组成。Hb
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α1和Hb
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α2亚基分别由HBA1和HBA2基因编码。Hb
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β亚基由HBB基因编码。成年人中少数血红蛋白呈由两个α和两个δ亚基组成的血红蛋白A2(HbA2)的形式。人出生时最常见的血红蛋白形式(在成人中也以少数存在)是由两个α和两个γ亚基组成的血红蛋白F(HbF)。血红蛋白链的氨基酸序列在物种间不同且在物种内也不同。在物种内，血红蛋白链的变体可能导致疾病或可能不导致疾病。
[0004]血红蛋白病是导致血红蛋白亚基结构异常的遗传缺陷。血红蛋白病的实例包括地中海贫血和镰状细胞病。
[0005]地中海贫血是一组遗传性血液病症，其特征在于异常血红蛋白的产生。地中海贫血的症状包括贫血和体内铁过多。据估计，2013年全球有2.8亿人患有地中海贫血。2015年大约有16,800人因地中海贫血而死亡。地中海贫血以常染色体隐性方式遗传，这意味着父母双方都必须携带地中海贫血，并且他们各自将其遗传给他们的孩子。地中海贫血是由导致产生异常红细胞的缺陷型α或β血红蛋白链引起的。α地中海贫血涉及α链缺陷。β地中海贫血涉及β链缺陷。缺陷的β链可导致产生的功能性血红蛋白的量减少(β+)或不产生功能性血红蛋白(β0)。遗传两个β0等位基因导致β地中海贫血的最严重形式，而遗传一个突变等位基因和一个正常等位基因可能不产生任何症状。遗传一个或两个β+等位基因导致中等严重程度的疾病。地中海贫血目前通过定期输血、铁螯合、叶酸或骨髓移植来治疗。
[0006]镰状细胞病是一组遗传性血液病症，其特征在于刚性镰刀状红细胞。这些细胞不太可能变形穿过毛细血管，从而导致血管阻塞和缺血。镰状细胞被身体破坏，但以较慢的速率被替换，从而导致贫血。镰状细胞病的症状包括疼痛发作、感染风险增加、贫血和中风。这些症状可通过止痛药、抗生素和输血来控制。造血干细胞或骨髓移植可潜在地治愈镰状细胞病，但这些都涉及重大风险。据估计，2015年，全世界有440万人患有镰状细胞病，并且大约114,800人因其死亡。
[0007]地中海贫血的起因中的一个是血红蛋白E。血红蛋白E(HbE)是由于人HBB基因的第27密码子的点突变。野生型密码子是编码谷氨酸残基的GAG。HbE的密码子是编码赖氨酸残
基的GAA。HbE在印度、中国和东南亚的部分地区具有较高的流行率(高达70％的人口是携带者)，因为其赋予对也在这些地区流行的疟疾的防护。HbE变体减少了β
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球蛋白链的产生。当HbE变体与HBB基因的另一等位基因的β
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地中海贫血突变组合遗传时，可发展严重的HbEβ
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地中海贫血。此种组合导致全球所有严重地中海贫血中的大约50％，这相当于每年大约20,000人出生。这些患病者需要在他们的生命中每2
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3周输血。
[0008]血红蛋白S(HbS)是HBB基因的变体形式，其中第7密码子是GTG(缬氨酸)，而不是野生型GAG(谷氨酸)。HbS导致纯合型或与HbC或另一等位基因的地中海贫血突变组合的镰状细胞病。
[0009]另一种血红蛋白病是血红蛋白C(HbC)疾病。这是遗传性疾病，其中β亚基的位置7处的谷氨酸残基被赖氨酸残基取代。大多数患病者不具有任何症状，但症状可包括脾肿大和溶血性贫血。血红蛋白C以常染色体隐性方式遗传。通常不需要治疗，但叶酸补充可帮助产生正常的红细胞，并减少所引起的贫血的症状。然而，当血红蛋白C与另一等位基因的血红蛋白S共遗传时，产生与镰状细胞病具有类似表型的血红蛋白SC疾病。
[0010]一些基因治疗方法最近已被描述为治疗各种血红蛋白病，但这些方法具有显著的安全问题，因为HBB基因的额外拷贝在数千个不同的位点随机整合到基因组中，导致插入突变和恶性肿瘤的可能性。这些方法也可能不如本文提出的方法有效，因为它们不能修正基因组中的突变，从而使异常珠蛋白链的产生完整。另外，与我们的方法相比，它们不能使用高水平血红蛋白表达所需的全部调控元件。
[0011]已描述了用于治疗HbEβ地中海贫血和镰状细胞病的基因组编辑的几种方法，所述方法包括以下：
[0012]1.进行通过诱变启动子β珠蛋白基因或BCL11A基因或其增强子(其导致胎儿与成人形式的血红蛋白之间的转换)的常规Cas9诱导的缺失，以重新激活胎儿血红蛋白的表达。
[0013]2.进行α
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珠蛋白基因(HBA)的主要调控元件的缺失，以降低由HbEβ地中海贫血中过量α珠蛋白链引起的毒性。
[0014]3.使用DNA模板和在β珠蛋白基因上切割的常规Cas9，以使用同源性定向修复途径修正HbS和HbE突变，但此种情况以低效率发生并且涉及在DNA中产生双链断裂。
[0015]如上所述，这些血红蛋白病中的一些也可通过定期输血来治疗。然而，经受这些手术的患者有铁超负荷；发展多种输注相关抗体；过度溶血和受污染的血液制品感染的风险。针对血红蛋白病的骨髓移植在兄弟姐妹匹配的最好情况下带来约3％死亡率的风险，并且此种死亡率在18岁时上升到不可接受的高水平(>10％)。因此，希望找到进一步的方法来治疗且优选治愈此类病人。
[0016]诸如CRISPR
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Cas9的基因编辑技术的出现意味着修正上述血红蛋白病潜在的遗传缺陷已成为可能。然而，在使用基于CRISPR
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Cas9的方法时，潜在的脱靶效应的有害后果仍是问题。
[0017]碱基编辑是遗传编辑的形式，其中一个碱基对在目标基因座上永久地转化为另一个碱基对。碱基编辑器由相关指导RNA引导到它们的靶点。与其他基因编辑方法不同，碱基编辑不将任何双链DNA断裂引入到靶DNA中；它不需要非同源性末端接合或同源性定向修复方法；并且本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于制备修饰的核酸分子的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使包含编码突变型Hb
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β多肽的突变型HBB基因的核酸分子与碱基编辑器接触，其中所述突变型HBB基因包含编码第一非野生型氨基酸的第一非野生型密码子；以及(b)在使得所述碱基编辑器靶向所述第一非野生型密码子的核苷酸序列并且其中所述碱基编辑器编辑所述第一非野生型密码子中的一个或多个核苷酸以产生编码第二非野生型氨基酸的第二非野生型密码子的条件下，培育所述突变型HBB基因和碱基编辑器，从而产生包含编码编辑的Hb
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β多肽的编辑的HBB基因的修饰的核酸分子，其中所述编辑的Hb
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β多肽具有非野生型但表型上可行的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的方法，其中：步骤(a)包括使包含编码突变型Hb
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β多肽的突变型HBB基因的核酸分子与碱基编辑器和gRNA接触，其中所述突变型HBB基因包含编码第一非野生型氨基酸的第一非野生型密码子，并且其中所述gRNA能够将所述碱基编辑器靶向所述突变型HBB基因的第一非野生型密码子的核苷酸序列；以及步骤(b)包括在使得所述gRNA将所述碱基编辑器靶向所述第一非野生型密码子的核苷酸序列并且其中所述碱基编辑器编辑第一非野生型密码子中的一个或多个核苷酸以产生编码第二非野生型氨基酸的第二非野生型密码子的条件下，培育突变型HBB基因和碱基编辑器，从而产生包含编辑的HBB基因的修饰的核酸分子。3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述HBB基因为哺乳动物基因，优选人基因。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中突变型HBB基因由编码与SEQ ID NO:2具有90
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99.5％、更优选95
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99.5％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列组成或包含所述核苷酸序列。5.如权利要求4所述的方法，其中与SEQ ID NO:1中的第7密码子相对应的密码子处的所述核苷酸序列编码赖氨酸或缬氨酸；且/或与SEQ ID NO:1中的第27密码子相对应的密码子处的核苷酸序列编码赖氨酸。6.如权利要求5所述的方法，其中与SEQ ID NO:1中的第7密码子相对应的第一非野生型密码子处的所述核苷酸序列为AAG或GTG；且/或与SEQ ID NO:1中的第27密码子相对应的第一非野生型密码子处的核苷酸序列为AAG。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述碱基编辑器是能够靶向靶DNA序列的可编程核酸结合蛋白(优选受损的CRISPR
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Cas9突变体)。8.如权利要求7所述的方法，其中所述碱基编辑器为腺嘌呤脱氨基编辑器。9.如权利要求2至8中任一项所述的方法，其中：(i)用于编辑第7密码子的所述指导RNA序列为18
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22核苷酸指导RNA，其与位于SEQ ID NO:15的核苷酸序列互补，其中所述野生型第7密码子补体(CTC)被CAC替代；或(ii)用于编辑第7密码子的所述指导RNA序列为18
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22核苷酸指导RNA，其位于SEQ ID NO:16，其中所述野生型第27密码子(GAG)被AAG替代；或(iii)用于编辑第7密码子的所述指导RNA序列为18
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22核苷酸指...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯，
申请(专利权)人：牛津大学创新有限公司，
类型：发明
国别省市：